Kiểm tra độ tinh khiết của từng thành phần bằng sắc ký khí và bằng phương pháp phân tích lý-hóa thông thường.

Bảo quản hỗn hợp trong chai kín, tránh ánh sáng và ở nhiệt độ trong khoảng từ - 5^oC đến + 5^oC. Khi hỗn hợp thử này được bảo quản trong điều kiện trên thì có thể bền ít nhất một năm.

7.3. Cách tiến hành

Tiến hành phân tích sắc ký trên hỗn hợp thử bằng cách bơm tinh dầu thử nghiệm trong các điều kiện thao tác thông thường trong phòng thử nghiệm.

7.4. Kết quả

Các kết quả thu được trực tiếp từ hệ thống phân tích dữ liệu.

Dữ liệu thu được, biểu thị bằng phần trăm diện tích, phải nằm trong giới hạn quy định trong Bảng 2.

Bảng 2 - Mẫu sắc đồ của hỗn hợp thử chuẩn

Tên hóa học

...

...

...

%

Tối đa

%

n-Hexanol

0,65

0,75

a-Pinen

5,85

6,25

...

...

...

49,0

50,5

Linalool

10,10

10,50

n-Decanal

0,15

0,20

Linalyl axetat

...

...

...

23,50

Eugenol

2,50

2,75

b-Caryophyllen

5,85

6,30

Benzyl salixylat

0,75

...

...

...

Tỷ lệ n-Hexanol/benzyl salixylat

0,75

0,95

Đối với pic của n-decanal, tỷ lệ tín hiệu - nhiễu phải lớn hơn 100. Tỷ lệ này có thể tính được như sau:

- tín hiệu là chiều cao pic của decanal;

- độ nhiễu là một nửa chênh lệch giữa giá trị tín hiệu tối đa và tối thiểu khi pic không xuất hiện trong 30 s.

8. Chuẩn bị mẫu thử

Chuẩn bị mẫu thử phù hợp với phương pháp quy định trong TCVN 8443 (ISO 356).

9. Nhận biết và chọn các thành phần đại diện và đặc trưng của tinh dầu

...

...

...

Nhận biết các thành phần hóa học chính, sử dụng phương pháp phân tích thông thường.

Lựa chọn một vài thành phần trong số các thành phần đặc trưng và đại diện nhất của tinh dầu cần xác định (tối đa là 12).

10. Cố định giới hạn nồng độ

Cài đặt máy tích phân sao cho loại trừ được nhiễu nền.

Đánh giá nồng độ gần đúng các thành phần đại diện và đặc trưng của từng mẫu tinh dầu cần xác định, sử dụng phương pháp chuẩn hóa diện tích pic (phương pháp chuẩn hóa nội) phù hợp với TCVN 9653 (ISO 7609). Phương pháp này cho phép đánh giá từng thành phần, phần trăm diện tích pic liên quan đến tổng diện tích của tất cả các pic trên sắc đồ tinh dầu được lấy để xác định bằng máy tính phân. Tỷ lệ phần trăm này có thể so sánh với nồng độ đọc được trực tiếp từ hệ thống dữ liệu.

Đối với mỗi thành phần của mẫu cần nghiên cứu, tính nồng độ trung bình, m₁ và độ lệch chuẩn s₁.

Xác định độ tin cậy ở 95 %, sử dụng công thức sau:

m₁ ± 1,96 s₁

Tất cả các giá trị nằm ngoài độ tin cậy này được coi là ngoại lệ và phải loại bỏ.

...

...

...

Xác định lại độ tin cậy sử dụng công thức sau:

m₂ ± 1,96 s₂

Tất cả các giá trị nằm ngoài độ tin cậy này bị coi là ngoại lệ và phải loại bỏ.

Tiếp tục tiến hành như vậy để loại dần cho đến khi không còn giá trị nào bị loại bỏ.

Giá trị độ tin cậy cuối cùng này tạo thành các giới hạn trên và giới hạn dưới của các nồng độ có thể chấp nhận được.

Có thể biểu thị các giới hạn theo tỷ lệ giữa các thành phần nếu điều này cho phép cải thiện hiệu quả đánh giá chất lượng, nếu cần.

Làm tròn các giá trị giới hạn thu được đến số nguyên hoặc số bán nguyên, nếu cần.

Phụ lục B đưa ra ví dụ thực tế về ứng dụng của phương pháp, ví dụ này chỉ để tham khảo.

11. Biểu thị kết quả

...

...

...

12. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải nêu rõ phương pháp sử dụng và các kết quả thu được. Báo cáo thử nghiệm cũng phải đề cập đến mọi điều kiện thao tác hoặc phương pháp thống kê được sử dụng nhưng không quy định trong tiêu chuẩn này hoặc tùy chọn cùng với mọi chi tiết nào khác mà có thể ảnh hưởng đến kết quả thử nghiệm.

Cụ thể, báo cáo thử nghiệm phải nêu rõ số lượng mẫu tinh dầu được thử nghiệm số năm sản xuất.

Phụ lục A

(Tham khảo)

Ví dụ về việc sử dụng hỗn hợp thử để đánh giá xác nhận việc lắp đặt thiết bị sắc ký khí

Khi đánh giá xác nhận việc lắp đặt thiết bị, sử dụng cột mới, septum mới và cài đặt mới. Xem Bảng A.1 và Bảng A.2.

Bảng A.1 - Sử dụng các pic cụ thể để cài đặt sắc ký khí

...

...

...

Chiều cao không vượt quá dải từ 30 % đến 40 % trên toàn bộ thang đo (ví dụ 300 mV đến 400 mV cho 1 V cổng ra)

Hình dạng pic phải đối xứng, cụ thể, pic dầu bạch đàn có phần đồ thị đi lên không đều cho thấy sự quá tải của pha tĩnh

Pic decanal

Dùng chiều cao pic để xác định độ nhạy của máy tích phân (loại trừ nhiễu nền)

Bảng A.2 - Quan sát dựa trên nền hỗn hợp thử

Nguyên nhân

Kết quả

Cột chưa được ổn định tốt

Decanal nhỏ hơn dải quy định, pic bị kéo đuôi

...

...

...

Benzyl salicylat nhỏ hơn dải quy định, pic bị kéo đuôi

Đầu bơm mẫu bị bẩn

Linalyl axetat < 22 % và xuất hiện pic myrcen

Cài đặt ngọn lửa kém (không đủ oxy)

Eucalyptol > 52 %, linalyl axetat < 22 %

Lượng bơm ít (hóa hơi không hết)

Eucalyptol > 55 %, hexanol > 0,8 %, a-pinen > 7 %

Tất cả các thành phần khác thấp hơn giới hạn dưới

...

...

...

(Tham khảo)

Ví dụ thực tế về việc thiết lập mẫu sắc đồ của tinh dầu cây xô thơm

(Salvia officinalis L.)

B.1. Áp dụng Điều 5

Mẫu sắc đồ được thiết lập sau khi phân tích hơn 80 mẫu tinh dầu đã sản xuất 6 năm và của 9 quốc gia.

B.2. Áp dụng Điều 7

Chọn các điều kiện thao tác thích hợp cho phép phân tích sắc ký của tinh dầu và tiến hành đánh giá hiệu năng của thiết bị bằng cách sử dụng hỗn hợp thử chuẩn như đã nêu.

B.3. Áp dụng Điều 9

B.3.1. Nghiên cứu phân tích

...

...

...

1 a-pinen

2 camphen

3 b-pinen

4 sabinen

5 myrcen

6 a-terpinen

7 limonen

8 1,8-cineol

9 cis-ocimen

...

...

...

11 trans-ocimen

12 para-cymen

13 terpinolen

14 a-thujon

15 b-thujon

16 camphor

17 linalool

18 linalyl axetat

19 bornyl axetat

...

...

...

21 terpinen-4-ol

22 a-humulen

23 a-terpineol + berneol

24 caryophyllen oxit

25 viridiflorol

B.3.2. Chọn mẫu

Trong số 80 mẫu tinh dầu được nghiên cứu, các chuyên gia thống nhất loại bỏ 9 mẫu, thành phần hóa học của chúng được coi là rất khác với tinh dầu cây xô thơm (Salvia officinalis L.), số mẫu còn lại được coi là tinh khiết và có chất lượng cảm quan tốt.

CHÚ THÍCH: Đối với 9 mẫu bị loại bỏ này, hàm lượng a- và b-thujon (nhỏ hơn 2 %) và hàm lượng 1,8-cineole (lớn hơn 20 %) là rất khác thường. Với lý do này có thể gây nhầm lẫn hoặc hiểu lầm giữa tinh dầu của xô thơm với tinh dầu của các loài thực vât khác.

B.3.3. Chọn các thành phần đại diện

...

...

...

a-pinen

camphen

a-terpinen

limonen

1,8-cineol

g-terpinen

terpinolen

b-thujon

bornyl axetat

...

...

...

a-humulen

berneol + a-terpineol

B.3.4. Chọn các thành phần đặc trưng

B.3.4.1. Một hàm lượng rất nhỏ của linalool và linalyl axetat cho phép phân biệt tinh dầu cây xô thơm (Salvia officinalis L.) với tinh dầu cây xô thơm clary (Salvia sclarea L.) vì Salvia officinalis chứa ít hơn 1 % nồng độ linalool và linalyl axetat, trong khi xô thơm clary thường chứa nhiều hơn 60 %.

Do vậy, linalool và linalyl axetat được chọn (các hợp chất này đôi khi không tách được).

B.3.4.2. Hàm lượng 1,8-cineol giúp tránh được sự nhầm lẫn giữa tinh dầu cây xô thơm Tây Ban Nha (Salvia lavandulifolia) chứa trên 20 % và Salvia officinaliss chứa từ 5 % đến 13 % hàm lượng này.

Do vậy, 1,8-cineol được chọn.

B.3.4.3. Tinh dầu Salvia officinalis có lượng độc tố nhất định do sự có mặt của camphor và hai đồng phân a- và b-thujon, và các quy định hiện hành của quốc gia và Cộng đồng châu Âu đã quy định mức giới hạn nồng độ của các thành phần này trong thực phẩm. Do vậy, cần đánh giá các thành phần này trong tinh dầu.

Vì b-thujon có trong danh mục nêu trên, nên cần phần đưa a-thujon và camphor vào danh mục này.

...

...

...

B.3.5. Thành phần trong danh mục

Với 12 thành phần đại diện, được bổ sung thêm các thành phần đặc trưng, như a-thujon và camphor do độc tính và linaool với linalyl axetat để tránh nhầm lẫn. Vì vậy, trong danh mục này có tất cả 16 thành phần (trong ví dụ được chọn, 1,8-cineol vừa là thành phần đại diện vừa là thành phần đặc trưng).

Như đã nêu trong Điều 9, danh mục này không nên vượt quá 12 thành phần và danh mục 16 thành phần là quá nhiều.

Sau khi kiểm tra, các thành phần có nồng độ quá nhỏ đã bị loại bỏ, cụ thể là:

a-terpinen

g-terpinen

terpinolen

terpinen-4-ol

Cặp "borneol + a-terpineol" cũng bị loại bỏ do rất khó tách trong các điều kiện thực hiện.

...

...

...

Đối với mẫu sắc đồ của tinh dầu cây xô thơm (Salvia officinalis L.) thì 10 thành phần đại diện và/hoặc đặc trưng đã được chọn là:

a-pinen

camphen

limonen

1,8-cineol

a-thujon

b-thujon

camphor

linalool + linalyl axetat

...

...

...

a-humulen

B.4. Áp dụng điều 10

B.4.1. Cố định các giới hạn nồng độ

Việc đánh giá nồng độ xấp xỉ của 10 thành phần đại diện và đặc trưng trong 71 mẫu tinh dầu cây xô thơm (Salvia officinalis L.) đã được tiến hành sử dụng phương pháp chuẩn hóa diện tích pic (phương pháp chuẩn hóa nội) theo TCVN 9653 (ISO 7609).

Tính nồng độ trung bình, m₁ và độ lệch chuẩn s₁ đã được tính cho mỗi thành phần.

Nồng độ tối thiểu và tối đa tính được sử dụng công thức sau:

m₁ = ± 1,96 s₁

Các tinh dầu có giá trị nằm ngoài giới hạn trên và giới hạn dưới phải bị loại bỏ.

Tính được nồng độ trung bình mới m₂ và độ lệch chuẩn mới s₂. Điều này cho phép tính giới hạn trên và giới hạn dưới mới, sau đó loại trừ các giá trị nằm ngoài các giới hạn mới này.

...

...

...

B.4.2.  Ví dụ

Xem Bảng B.1

Bảng B.1 - Ví dụ về giới hạn nồng độ cho phép

Thành phần

Trung bình

Độ lệch chuẩn

Giới hạn dưới

Giới hạn trên

Giá trị nồng độ

...

...

...

3,56

1,47

1,27

6,39

1

6,5

Camphen

3,74

1,55

...

...

...

6,54

1,5

7

Limonen

1,66

0,58

0,71

2,62

0,5

...

...

...

1,8-Cineol

8,52

2,80

5,65

12,72

5,5

13

a-Thujon

31,60

...

...

...

18,64

42,64

18

43

b-thujon

5,16

1,73

3,04

8,22

...

...

...

8,5

Camphor

13,34

6,96

4,92

24,09

4,5

24,5

Linalool

...

...

...

0,14

0,26

0,64

0

1

Linalyl axetat

0

0

0

...

...

...

Bornyl axetat

1,10

0,45

0,27

2,18

0

2,5

...

...

...

5,56

3,32

0

11,93

0

12

Hình B.1 và Hình B.2, đưa ra chỉ để tham khảo, một vài sắc đồ điển hình thu được khi phân tích sắc ký tinh dầu cây xô thơm (Salvia officinalis L.) bằng sắc ký khí trên cột mao quản sử dụng hai kiểu pha: polyetylen glycol 20 000 (pha phân cực) và OV 1701 (pha không phân cực).

Nhận biết pic

...

...

...

1 a-pinen

2 camphen

3 b-pinen

4 sabinen

5 myrcen

6 a-terpinen

7 limonen

8 1,8-cineol

9 cis-ocimen

...

...

...

11 trans-ocimen

12 para-cymen

13 terpinolen

14 a-thujon

15 b-thujon

16 camphor

17 linalool

18 linalyl axetat

19 bornyl axetat

...

...

...

21 terpinen-4-ol

22 a-humulen

23 a-terpineol + berneol

24 caryophyllen oxit

25 viridiflorol

Cột: mao quản, silica nóng chảy, dài 50 m, đường kính trong 0,32 mm

Pha tĩnh: polyethylen glycol 20 000

Nhiệt độ lò: đẳng nhiệt ban đầu ở 70 ^oC trong 15 min, sau đó tăng từ 70 ^oC lên 180 ^oC ở tốc độ 2 ^oC/min và đẳng nhiệt khi kết thúc ở 180 ^oC trong 15 min.

Nhiệt độ bơm: 180 ^oC

...

...

...

Detector: ion hóa ngọn lửa

Khí mang: hydro, 0,5 bar

Thể tích bơm: 0,1 ml

Tỷ lệ chia dòng: 1/100

Hình B.1 - Sắc đồ điển hình của dầu Salvia officinalis L. trên pha phân cực

Nhận diện pic

Điều kiện vận hành

1 a-pinen

...

...

...

3 b-pinen

4 sabinen

5 myrcen

6 a-terpinen

7 limonen

8 1,8-cineol

9 cis-ocimen

10 g-terpinen

11 trans-ocimen

...

...

...

13 terpinolen

14 a-thujon

15 b-thujon

16 camphor

17 linalool

18 linalyl axetat

19 bornyl axetat

20 b-caryophyllen

21 terpinen-4-ol

...

...

...

23 a-terpineol + berneol

24 caryophyllen oxit

25 viridiflorol

Cột: cột mao quản, silica nóng chảy, dài 50 m, đường kính trong 0,32 mm

Pha tĩnh: OV 1701

Nhiệt độ lò: đẳng nhiệt ban đầu ở 70 ^oC trong 15 min, sau đó tăng từ 70 ^oC lên 180 ^oC ở tốc độ 2 ^oC/min và đẳng nhiệt khi kết thúc ở 180 ^oC trong 15 min.

Nhiệt độ bơm: 180 ^oC

Nhiệt độ detector: 200 ^oC

Detector: ion hóa ngọn lửa

...

...

...

Thể tích bơm: 0,1 ml

Tỷ lệ chia dòng: 1/100

Hình B.2 - Sắc đồ điển hình của dầu Salvia officinalis L. trên pha không phân cực