5. Phương pháp thử

5.1. Xác định độ hòa tan, theo 3.7 trong TCVN 6469:2010.

5.2. Phép thử carotenoid

Thêm lần lượt dung dịch natri nitrit 5% và dung dịch axit sulfuric 0,5M vào dung dịch mẫu thử trong axeton, dung dịch mẫu thử bị mất màu.

5.3. Phương pháp nhận biết bằng đo quang phổ

Xác định độ hấp thụ (A) của dung dịch mẫu thử đã pha loãng (xem 5.4) tại các bước sóng 449 nm và 475 nm. Tỷ số A₄₇₅/A₄₄₉ phải nằm trong khoảng từ 0,82 đến 0,86.

5.4. Xác định hàm lượng chất màu tổng số, theo 3.3.1.4 (Phương pháp đo quang phổ) trong TCVN 6470:2010.

5.4.1. Điều kiện xác định bằng quang phổ

- Khối lượng mẫu thử:                              0,08 g ± 0,01 g;

...

...

...

- Dung tích các pipet:                               v₁ = v₂ = 5 ml;

- Độ hấp thụ riêng của chất chuẩn:            ;

- Bước sóng tương ứng với độ hấp thụ cực đại: khoảng 449 nm.

5.4.2. Tính kết quả

Hàm lượng chất màu tổng hợp của mẫu thử, X₁, được tính bằng phần trăm khối lượng (%) theo công thức sau:

Trong đó:

A là độ hấp thụ của dung dịch mẫu thử được pha loãng hai lần tại bước sóng 461 nm;

 là độ hấp thụ riêng của β-caroten ( = 2550);

...

...

...

D là hệ số pha loãng ();

w là khối lượng mẫu thử, tính bằng gam (g).

5.5. Xác định hàm lượng chất màu phụ

5.5.1. Thuốc thử

Chỉ sử dụng thuốc thử tinh khiết phân tích, nước sử dụng phải là nước cất hoặc nước có chất lượng tương đương.

5.5.1.1. Hydroxytoluen đã butyl hóa (BHT)

5.5.1.2. 2-Propanol.

5.5.1.3. N-etyldiisopropyl – amin.

5.5.1.4. Amoni axetat, dung dịch 0,2%.

...

...

...

5.5.1.6. Metanol.

5.5.1.7. Etanol.

5.5.1.8. Tetrahydrofuran.

5.5.1.9. Dung môi pha động

Hòa tan 50 mg BHT (5.5.1.1) trong 20 ml 2-propanol (5.5.1.2) đựng trong bình định mức 1 000 ml. Thêm 0,2 ml N-etyldiiopropyl-amin (5.5.1.3), 25 ml dung dịch amoni axetat 0,2% (5.5.1.4), 455 ml axetonitril (5.5.1.5) và khoảng 450 ml metanol (5.5.1.6). Để cho hỗn hợp về nhiệt độ phòng và thêm metanol đến vạch.

Sử dụng dung môi pha động trong vòng 2 ngày sau khi chuẩn bị.

5.5.2. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

5.5.2.1. Thiết bị HPLC, được trang bị detector UV/VIS hoặc detector mảng diot, bộ bơm mẫu tự động có làm lạnh và bộ tích phân.

...

...

...

5.5.2.3. Bình định mức, dung tích 100 ml và 1000 ml.

5.5.2.4. Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,1 mg.

5.5.3. Cách tiến hành

5.5.3.1. Chuẩn bị dung dịch mẫu thử

Cân 10 mg mẫu thử, chính xác đến 0,1 mg, hòa tan trong tetrahydrofuran (5.5.1.8) (đã được ổn định bằng dung dịch BHT 0,025%). Chuyển hỗn hợp sang bình định mức 100 ml (5.5.2.3) và thêm tetrahydrofuran đến vạch.

Pha loãng dung dịch thu được với etanol (5.5.1.7) theo tỉ lệ thể tích 1:10.

5.5.3.2. Điều kiện sắc kí

- Bước sóng detector:                              446 nm;

- Cột:                                                       theo 5.5.2.2;

...

...

...

- Rửa giải:                                                đẳng dòng;

- Nhiệt độ cột:                                          30 ^oC;

- Tốc độ dòng:                                         0,6 ml/min;

- Thể tích bơm:                                         10 μl;

- Nhiệt độ bộ bơm lấy mẫu tự động:         khoảng 15 ^oC;

- Thời gian chạy sắc kí:                             khoảng 35 min.

5.5.3.3. Tiến hành sắc kí

Bơm dung dịch mẫu thử vào hệ thống HPLC. Thời gian lưu của etyl este của axit all-trans-β-apo-8’-carotenoic nằm trong khoảng từ 9 min đến 11 min và tương ứng với pic lớn nhất trên sắc kí đồ. Thời gian lưu tương đối của các carotenoid so với etyl este của axit all-trans-β-apo-8’-carotenoic là: all-trans-β-apo-12’-carotenal (0,73), metyl-all-trans-β-apo-8’-carotenoat (0,97), all-trans-etyl 4’-apo-β-carotenat (1,22) và all-trans-β-caroten (2,23).

Tích phân diện tích các pic trên sắc kí đồ.

...

...

...

Hàm lượng các carotenoid ngoại trừ etyl este của axit β-apo-8’-carotenoic, X₂, biểu thị bằng phần trăm khối lượng so với chất màu tổng số, tính theo công thức sau:

Trong đó:

A_t là tổng diện tích các pic trên sắc kí đồ, ngoại trừ pic của dung môi, tính theo đơn vị diện tích.

A_a là diện tích pic của etyl este của axit β-apo-8’-carotenoic trên sắc kí đồ, tính theo đơn vị diện tích.

5.6. Xác định hàm lượng tro sulfat, theo 5.3.3.1.1 trong TCVN 8900-2:2012, sử dụng 2 g mẫu thử.

5.7. Xác định hàm lượng chì, theo TCVN 8900-6:2012, TCVN 8900-7:2012 hoặc TCVN 8900-8:2012.