8.2. Các điều kiện vận hành HPLC

Khi cột đáp ứng quy định kỹ thuật trong 5.13.3, (kích thước 4,6 mm x 250 mm với cỡ hạt 5 mm) và pha động quy định trong 4.17 được sử dụng, việc cài đặt sau đây là thích hợp:

- Tốc độ dòng pha động (cột): 1,0 ml/min;

- Detector huỳnh quang, bước sóng kích thích: 460 nm;

                                     bước sóng phát xạ: 333 nm;

- Thể tích bơm: 100 ml (V₄)

8.3. Nhận biết

Nhận biết chất phân tích bằng cách so sánh thời gian lưu của pic liên quan trong mẫu với pic của chất chuẩn trong sắc đồ.

Đôi khi có thể cần nhận biết pic bằng cách bơm đồng thời dung dịch mẫu thử và dung dịch chuẩn.

...

...

...

Tiến hành xác định bằng phương pháp ngoại chuẩn, tích phân diện tích pic hoặc xác định chiều cao pic và so sánh các kết quả với các giá trị tương ứng với chất chuẩn có diện tích pic hoặc chiều cao pic gần nhất hoặc sử dụng đường chuẩn. Trong trường hợp sử dụng đường chuẩn, thì có thể chuẩn bị các dung dịch bổ sung có các nồng độ mẫu nằm trong dải tuyến tính được chuẩn bị cho đường chuẩn.

Bơm các thể tích bằng nhau của dung dịch mẫu thử và dung dịch chuẩn dùng cho đường chuẩn.

Nếu tín hiệu ochratoxin A của mẫu nằm ngoài dải hiệu chuẩn thì chỉnh lượng mẫu đã bơm bằng cách pha loãng dung dịch mẫu thử.

9. Tính kết quả

Đọc từ đường chuẩn hàm lượng ochratoxin A, có trong phần dịch lỏng của dung dịch thử nghiệm được bơm lên cột HPLC, tính bằng nanogam.

Tính nồng độ khối lượng của ochratoxin A, w_OTA, bằng microgam trên kilogam (mg/kg), dùng Công thức (2):

Trong đó:

m_a

...

...

...

 V₄

là thể tích phần dịch lỏng của dung dịch thử nghiệm đã được bơm lên cột (8.2), tính bằng mililit (ml);

V₃

là thể tích dung dịch thử (6.1.3, 6.2.3), (V₃ = 1,0 ml), tính bằng mililit (ml);

V₂

là thể tích dịch lọc của mẫu được lấy để làm sạch, [đối với lúa mạch V₂ = 4,0 ml (6.1.2), đối với cà phê rang V₂ = 10 ml (6.2.2)], tính bằng mililit (ml);

V₁

là thể tích của dung môi chiết, (đối với lúa mạch V₁ = 100 ml, đối với cà phê rang V₁ = 150 ml), tính bằng mililit (ml);

m_s

...

...

...

Biểu thị kết quả cuối cùng bằng microgam trên kilogam vì đơn vị đo này cũng tương đương với nanogam trên gam.

10. Độ chụm

10.1. Phép thử liên phòng thử nghiệm

Các chi tiết về phép thử liên phòng thử nghiệm để xác định độ chụm của phương pháp được nêu trong Phụ lục A. Các giá trị thu được từ phép thử liên phòng thử nghiệm này có thể không áp dụng cho các dải nồng độ và các chất nền khác với các giá trị nêu trong Phụ lục A.

10.2. Độ lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả của hai phép thử nghiệm đơn lẻ thu được trên vật liệu thử giống hệt nhau, do một người thực hiện, sử dụng cùng thiết bị, trong một khoảng thời gian ngắn, không được quá 5% các trường hợp vượt quá giới hạn lặp lại r.

Các giá trị đối với lúa mạch là:

= 0,1 mg/kg    r = 0,112 mg/kg (mẫu trắng)

= 1,3 mg/kg    r = 0,896 mg/kg (mẫu bị nhiễm tự nhiên)

...

...

...

= 3,7 mg/kg    r = 0,448 mg/kg (mẫu bổ sung chuẩn)

= 4,5 mg/kg    r = 1,792 mg/kg (mẫu bị nhiễm tự nhiên)

Các giá trị đối với cà phê rang là: 

= 0,2 mg/kg    r = 0,112 mg/kg (mẫu trắng)

= 1,2 mg/kg    r = 0,756 mg/kg (mẫu bị nhiễm tự nhiên)

= 2,7 mg/kg    r = 0,868 mg/kg (mẫu bị nhiễm tự nhiên)

= 3,5 mg/kg    r = 0,588 mg/kg (mẫu bổ sung chuẩn)

= 5,5 mg/kg    r = 0,308 mg/kg (mẫu bị nhiễm tự nhiên)

10.3. Độ tái lập

...

...

...

Các giá trị đối với lúa mạch là:  

= 0,1 mg/kg    R = 0,280 mg/kg (mẫu trắng)

= 1,3 mg/kg    R = 1,232 mg/kg (mẫu bị nhiễm tự nhiên)

= 3,0 mg/kg    R = 1,456 mg/kg (mẫu bị nhiễm tự nhiên)

= 3,7 mg/kg    R = 1,204 mg/kg (mẫu bổ sung chuẩn)

= 4,5 mg/kg    R = 1,876 mg/kg (mẫu bị nhiễm tự nhiên)

Các giá trị đối với cà phê rang là:

= 0,2 mg/kg    R = 0,308 mg/kg (mẫu trắng)

= 1,2 mg/kg    R = 0,896 mg/kg (mẫu bị nhiễm tự nhiên)

...

...

...

= 3,5 mg/kg    R = 1,288 mg/kg (mẫu bổ sung chuẩn)

= 5,5 mg/kg    R = 2,184 mg/kg (mẫu bị nhiễm tự nhiên)

11. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm các thông tin sau đây:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử (loại mẫu, nguồn gốc của mẫu, tên gọi);

b) viện dẫn tiêu chuẩn này;

c) ngày và phương pháp lấy mẫu (nếu biết);

d) ngày nhận mẫu;

e) ngày thử nghiệm;

...

...

...

g) các điểm cụ thể quan sát được trong khi tiến hành thử nghiệm;

h) mọi chi tiết thao tác khác với quy định trong tiêu chuẩn này hoặc tùy chọn có thể ảnh hưởng đến kết quả thử nghiệm.

PHỤ LỤC A

(Tham khảo)

DỮ LIỆU VỀ ĐỘ CHỤM

Các dữ liệu sau đây thu được từ các phép thử liên phòng thử nghiệm [2], [3] theo nguyên tắc hài hòa [4].

Bảng A.1 - Dữ liệu về độ chụm đối với lúa mạch

Mẫu

...

...

...

Mức thấp

Mức trung bình

Mức cao

Mẫu mù

Năm tiến hành phép thử liên phòng thử nghiệm

1998/1999

1998/1999

1998/1999

1998/1999

...

...

...

Số lượng các phòng thử nghiệm

15

15

15

15

15

Số lượng các phòng thử nghiệm còn lại sau khi trừ ngoại lệ

14

15

...

...

...

12

12

Số lượng loại trừ (phòng thử nghiệm)

1

0

1

3

3

Số lượng các kết quả được chấp nhận

...

...

...

15

14

12

12

Giá trị trung bình, , mg/kg

0,1

1,3

3,0

4,5

...

...

...

Độ lệch chuẩn lặp lại s_r, mg/kg

0,04

0,32

0,37

0,64

0,16

Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại RSD_r, %

26

24

...

...

...

14

4

Giới hạn lặp lại r [r = 2,8 x s_r], mg/kg

0,112

0,896

1,036

1,792

0,448

Độ lệch chuẩn tái lập s_R, mg/kg

...

...

...

0,44

0,52

0,67

0,43

Độ lệch chuẩn tương đối tái lập RSD_R, %

72

33

17

15

...

...

...

Giới hạn tái lập R [R = 2,8 x s_R], mg/kg

0,280

1,232

1,456

1,876

1,204

Độ thu hồi, %

-

-

...

...

...

-

(93 ± 10)%

^a) Bộ dữ liệu đối với mẫu trắng ở mức giới hạn phát hiện.

Bảng A.2 - Dữ liệu về độ chụm đối với cà phê rang

Mẫu

Mẫu trắng ^a)

Mức thấp

Mức trung bình

Mức cao

...

...

...

Năm tiến hành phép thử liên phòng thử nghiệm

1998/1999

1998/1999

1998/1999

1998/1999

1998/1999

Số lượng các phòng thử nghiệm

15

15

...

...

...

15

15

Số lượng các phòng thử nghiệm còn lại sau khi trừ ngoại lệ

14

15

14

12

13

Số lượng phòng thử nghiệm đã loại trừ

...

...

...

0

1

3

2

Số lượng các kết quả được chấp nhận

14

15

14

12

...

...

...

Giá trị trung bình, , mg/kg

0,2

1,2

2,7

5,5

3,5

Độ lệch chuẩn lặp lại s_r, mg/kg

0,04

0,27

...

...

...

0,11

0,21

Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại RSD_r, %

28

22

11

2

6

Giới hạn lặp lại r [r = 2,8 x s_r], mg/kg

...

...

...

0,756

0,868

0,308

0,588

Độ lệch chuẩn tái lập s_R, mg/kg

0,11

0,32

0,40

0,78

...

...

...

Độ lệch chuẩn tương đối tái lập RSD_R, %

71

26

15

14

13

Giới hạn tái lập R [R = 2,8 x s_R], mg/kg

0,308

0,896

...

...

...

2,184

1,288

Độ thu hồi, %

-

-

-

-

(88 ± 15)%

^a) Bộ dữ liệu đối với mẫu trắng ở mức giới hạn phát hiện.

...

...

...

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Castegnaro M. Barek J., Fremy J.M., Lafontaine M., Miraglia M., Sansone E.B. and Telling G.M. Laboratory decontamination and destruction of carcinogens in laboratory wastes; some mycotoxins. IARC Scientific Publication No. 113, International Agency for Research on Cancer, Lyon (France), 1991, 63 p.

[2] EC, BRC Information, Report on Workpackage 4.9, Immunoaffinity Column Clean-up with Liquid Chromatography for the Determination of Ochratoxin A in Barley: Collaborative Study, Contract No. SMT4-CT96-2045, 1999, EUR 18954 EN

[3] EC, BRC Information, Report on Workpackage 4.9, Combined Phenyl Silan & Immunoaffinity Column Clean-up HPLC Method for the Determination of Ochratoxin A in Roasted Coffee: Collaborative Study, Contract No. SMT4-CT96-2045, 2000, EUR 19504 EN

[4] Guidelines for Collaborative Study to Validate Characteristics of a Method of Analysis" J.AOAC Int. 72, 1989, 694-704.