4.4.5.3. Chuẩn bị metyl este trong dung dịch isooctan

Tiếp tục đun sôi khoảng 3 min. Đối với dầu chứa các axit béo mạch dài, như dầu cá, thì tiếp tục đun sôi thêm 30 min.

Thêm lượng thích hợp (xem Bảng 1) của isooctan (4.4.3.4) vào hỗn hợp đun sôi qua đỉnh của bộ sinh hàn.

Tháo bình định mức ra khỏi nguồn nhiệt và tháo bình sinh hàn ra. Không để cho bình nguội, ngay lập tức thêm 20 ml dung dịch natri clorua (4.4.3.5). Đậy chặt bình và lắc mạnh ít nhất 15 s.

Thêm dung dịch natri clorua bão hòa để đưa mức chất lỏng của hỗn hợp lên đến cổ bình. Để hai pha tự phân tách.

Chuyển từ 1 ml đến 2 ml lớp isooctan phía trên vào lọ nhỏ 4 ml (4.4.4.5) và thêm một lượng nhỏ natri sulfat khan (4.4.3.6) để loại bỏ vết nước.

Dung dịch isooctan thu được thích hợp để phân tích sử dụng GC theo ISO 12966-4 như sau:

a) bơm trực tiếp lên cột nhồi đối với sắc kí khí lỏng;

b) pha loãng thích hợp bằng isooctan trước khi bơm khi sử dụng hệ thống cột mao quản;

...

...

...

4.4.5.4. Bảo quản các dung dịch metyl este

Tốt nhất là phân tích các este ngay khi có thể. Nếu cần, dung dịch isooctan chứa metyl este có thể được bảo quản trong khí trơ để trong tủ lạnh. Để thời gian bảo quản dài hơn, nên bảo vệ metyl este khỏi sự oxi hóa bằng cách thêm chất chống oxi hóa vào dung dịch ở nồng độ không cản trở phép phân tích tiếp theo, ví dụ dung dịch 2,6-di-t-butyl-4-metylphenol (BHT) 0,05 g/l. Các metyl este chứa metyl butyrat phải được bảo quản trong ống kín và có các biện pháp phòng ngừa đặc biệt để không làm thất thoát do bay hơi trong quá trình làm đầy và làm kín ống.

4.4.5.5. Bảo quản các metyl este khô

Các metyl este khô không có dung môi cần được phân tích ngay. Nếu cần, có thể bảo quản trong khí trơ ở trong tủ lạnh trong 24 h hoặc với thời gian dài hơn trong điều kiện chân không đựng trong ống đậy kín để trong tủ lạnh đông.

CHÚ THÍCH 1: Trong quá trình chạy GC của metyl este, một số thuốc thử nhất định có thể tạo ra các pic không mong muốn trên đồ thị. Đặc biệt trong suốt thời gian bảo quản dài, thì bo triflorua trong metanol có thể tạo ra các thành phần làm ảnh hưởng đến vùng các axit từ C₂₀ đến C₂₂.

CHÚ THÍCH 2: Hiệu quả của việc tạo dẫn suất có thể xác định được bằng TLC như trong Phụ lục A.

4.5. Chuyển hóa metyl đối với glycerid bằng xúc tác axit

4.5.1. Nguyên tắc

Thuốc thử metyl hóa trong axit tạo ra sự chuyển hóa metyl của este glyceryl thành các metyl este của axit béo. Thuốc thử metyl hóa cũng biến đổi các axit béo tự do thành các metyl este của axit béo.

...

...

...

Chỉ sử dụng thuốc thử thuộc loại tinh khiết phân tích và nước cất hoặc nước đã khử khoáng hoặc nước có chất lượng tương đương, trừ khi có quy định khác.

4.5.2.1. Axit sulfuric, r₂₀(H₂SO₄) = 1,84 g/ml.

4.5.2.2. Metanol, chứa lượng nước không quá 0,05 %.

4.5.2.3. Thuốc thử metyl hóa

Trong khi làm nguội, dùng pipet chia độ (4.5.3.2) thêm từ từ 1 ml axit sulfuric (4.5.2.1) vào pipet dung tích 15 ml (4.5.3.5) chứa metanol (4.5.2.2).

4.5.3. Thiết bị, dụng cụ

Chỉ sử dụng các thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

4.5.3.1. Cân phân tích, có thể đọc chính xác đến 10 mg.

4.5.3.2. Pipet chia độ, dung tích 1 ml và 5 ml, phù hợp với các yêu cầu quy định trong TCVN 7149 (ISO 835)^[1].

...

...

...

Có thể dùng các lọ tạo dẫn xuất thích hợp khác có kích thước tương tự để thay cho các ống bằng thủy tinh, với điều kiện là được đậy kín để không làm thất thoát các este dễ bay hơi.

4.5.3.4. Tủ sấy, có thể duy trì trong khoảng 100 °C đến 110 °C, hoặc nồi cách thủy đun sôi.

4.5.3.5. Pipet, dung tích 15 ml.

4.5.4. Chuẩn bị mẫu thử

Chuẩn bị mẫu thử theo quy định trong 4.1.

4.5.5. Cách tiến hành

Dùng cân phân tích (4.5.3.1) cân 100 mg mẫu đã chuẩn bị, chính xác đến 10 mg, cho vào ống thủy tinh (4.5.3.3). Thêm 0,4 ml thuốc thử metyl hóa (4.5.2.3). Hàn kín ống bằng ngọn lửa. Gia nhiệt ống thủy tinh chứa mẫu thử 3 h trong tủ sấy (4.5.3.4) duy trì trong khoảng từ 100 °C và 110 °C hoặc trong nồi cách thủy đun sôi (4.5.3.4) thỉnh thoảng trộn mẫu đựng trong ống.

Làm nguội ống thủy tinh và mẫu đến nhiệt độ phòng để tách pha hoàn toàn. Mở ống thủy tinh và giữ một phần pha lỏng phía trên để phân tích thêm. Có thể cần phải pha loãng các este tạo thành bằng dung môi thích hợp.

Dung dịch cuối cùng thích hợp để phân tích GC theo ISO 12966-4.

...

...

...

PHỤ LỤC A

(Tham khảo)

PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỚP MỎNG ĐỂ KIỂM TRA VIỆC TẠO DẪN XUẤT HOÀN TOÀN

A.1. Phạm vi áp dụng

Phụ lục này quy định phương pháp sắc kí lớp mỏng (TLC) để kiểm tra xác nhận xem việc tạo dẫn xuất thực hiện theo 4.2, 4.3, 4.4 hoặc 4.5 đã hoàn toàn hay chưa. Ngoài ra, quy trình này có thể có ích trong việc xác định thành phần chung của dầu hoặc mỡ trước khi quá trình dẫn xuất được thực hiện.

A.2. Nguyên tắc

Phương pháp TLC được sử dụng để tách các sản phẩm dẫn xuất hoặc các thành phần chung của mỡ và dầu trước khi tạo dẫn xuất. Các sản phẩm được nhận biết theo sự hiển thị của dạng axit molybdophosphoric hoặc hiển thị sử dụng hơi iot bằng cách so sánh vùng sản phẩm hiển thị với vùng của các chất thử nghiệm chạy trên cùng một đĩa.

Khi quá trình tạo dẫn xuất không hoàn toàn thì các sản phẩm phản ứng không chuyển hóa hết, như mono-, di- và triglycerid cũng như các axit béo tự do, vẫn có thể nhận biết được với nồng độ rất thấp.

...

...

...

A.3.1. Tấm TLC/HPTLC chuẩn bị sẵn hoặc tấm nhôm, có các kích thước khác nhau (ví dụ: 10 cm x 10 cm, 20 cm x 10 cm, 20 cm x 20 cm) được phủ bằng silica gel 60, độ dày từ 0,2 mm đến 0,25 mm. Các tấm này có thể cắt đôi thành các tấm 50 mm x 100 mm.

A.3.2. Ete dầu mỏ, dải sôi từ 40 °C đến 60 °C.

A.3.3. Dietyl ete, không chứa peroxit.

A.3.4. Axit axetic băng, 100 % khối lượng.

A.3.5. Axit molybdophosphoric.

A.3.6. Etanol, 95 % đến 96 % thể tích.

A.3.7. Dung dịch axit molybdophosphoric, axit molybdophosphoric (A.3.5) trong etanol (A.3.6), 3,5 % thể tích.

A.3.8. Iot tinh thể.

A.3.9. Pha động, hỗn hợp của ete dầu mỏ (A.3.2) (85 ml/101,5 ml thể tích) và dietyl ete (A.3.3) (15 ml/101,5 ml thể tích) và axit axetic (A.3.4) (15 ml/101,5 ml thể tích).

...

...

...

A.3.11. Kali permanganat.

A.3.12. Axit sulfuric, 95 % đến 97 % khối lượng.

A.3.13. Dung dịch kali permanganat, kali permanganat (A.3.11) trong axit sulfuric (A.3.12), nồng độ khối lượng khoảng 30 g/l.

A.4. Thiết bị, dụng cụ và vật liệu thử

A.4.1. Buồng sắc kí lớp mỏng, có vỏ bọc, đủ cỡ để chứa các tấm TLC.

A.4.2. Ống đong có nắp mài, dung tích 100 ml.

A.4.3. Pipet chia độ, dung tích 2 ml, được chia vạch 0,1 ml đơn vị, phù hợp với TCVN 7149 (ISO 835)^[1].

A.4.4. Ống mao quản.

A.4.5. Quả bóp hình quả lê.

...

...

...

A.4.7. Tủ sấy, có thể duy trì nhiệt độ ở khoảng 150 °C.

A.5. Cách tiến hành

A.5.1. TLC sử dụng axit molybdophosphoric để hiển thị

A.5.1.1 Chuẩn bị buồng sắc kí lớp mỏng

Xếp giấy lọc (A.4.6) quanh buồng TLC (A.4.1) để bão hòa dung môi.

Chuyển đủ pha động (A.3.9) sang buồng TLC để đạt được độ sâu khoảng 1 cm và đậy nắp. Sau khoảng 30 min buồng sẵn sàng để sử dụng.

A.5.1.2. Tính năng của phép thử

Dùng 1 ml đến 2 ml este hòa tan thu được từ 4.2, 4.3, 4.4 hoặc 4.5 cũng như các dung dịch của các chất thử nghiệm (A.3.10), chấm thành các chấm cách cạnh dưới của tấm (A.3.1) khoảng 2 cm và cách nhau khoảng 3 cm sử dụng ống mao quản (A.4.4).

Đặt tấm này vào buồng TLC đã chuẩn bị (A.5.1.1) và đậy nắp buồng sắc ký.

...

...

...

Phun dung dịch axit molybdophosphoric (A.3.7) lên tấm sắc ký và làm khô trong tủ sấy (A.4.7) khoảng 10 min để có thể nhìn thấy được các chất.

Các este của các axit béo bão hòa khó nhìn thấy bằng axit molybdophosphoric. Trong trường hợp này nên dùng hỗn hợp axit sulfuric và kali permanganat (A.3.13) làm thuốc thử.

A.5.2. TLC sử dụng hơi iot để hiển thị

A.5.2.1. Chuẩn bị buồng sắc kí lớp mỏng

Xếp giấy lọc (A.4.6) quanh buồng TLC (A.4.1) để bão hòa dung môi.

Chuyển đủ pha động (A.3.9) sang buồng TLC để đạt được độ sâu khoảng 1 cm và đậy nắp buồng. Sau khoảng 30 min buồng sẵn sàng để sử dụng.

A.5.2.2. Chuẩn bị buồng hiển thị hơi iot

Cho vài tinh thể iot (A.3.8) vào một buồng TLC (A.4.1) khác. Sau khoảng 30 min buồng sẵn sàng để sử dụng.

Các tinh thể iot luôn phải nhìn thấy ở đáy buồng.

...

...

...

Dùng 1 ml đến 2 ml este đã hòa tan thu được trong 4.2, 4.3, 4.4 hoặc 4.5 để chấm thành các chấm cách cạnh của tấm khoảng 2 cm từ cạnh dưới của đĩa (A.3.1) các chấm cách nhau 2 cm, sử dụng ống mao quản (A.4.4). Để đối chứng, có thể chấm các dung dịch của các chất thử nghiệm (A.3.10) trên tấm này hoặc các tấm khác.

Đặt tấm sáng vào buồng sắc kí đã chuẩn bị (A.5.2.1) và đậy nắp buồng.

Để cho dung môi pha động chạy lên đến đỉnh của tấm sắc kí. Lấy tấm này ra khỏi buồng và để khô trong không khí ở nhiệt độ môi trường khoảng vài phút.

Để đĩa trong buồng hiển thị hơi iot (A.5.2.2). Sau vài phút, các chấm cho thấy xuất hiện vị trí của các chất khác nhau.

A.5.3. Kết quả của phép xác định

Quá trình dẫn xuất cho thấy hoàn tất nếu không có mono-, di- hoặc triglycerid hoặc các axit béo có thể nhận biết đồng thời với các metyl este của axit béo và este propyl (Hình A.1). Lý tưởng nhất là có một chấm đơn ở vị trí của metyl este được xác định bằng cách sử dụng các chất thử nghiệm. Các chấm nhỏ ban đầu cho biết các chất không chứa glycerid (ví dụ: phospholipid) và các lipid phân cực.

Ngưỡng phát hiện đối với triglycerid không chuyển đổi hoặc các sản phẩm dẫn xuất là < 0,1 % sử dụng axit molybdophosphoric để hiển thị và < 1,0 % sử dụng hơi iốt để hiển thị.

CHÚ DẪN

...

...

...

1. Các metyl este của axit béo

2. triglycerid

3. các axit béo tự do

4. diglycerid

5. monoglycerid

Hình A.1 - Phép thử sắc kí lớp mỏng để kiểm tra việc tạo dẫn xuất hoàn toàn

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] TCVN 7150 (ISO 835), Dụng cụ thí nghiệm bằng thủy tinh - Pipet chia độ

...

...

...

[3] TCVN 4851 (ISO 3696), Nước dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm – Yêu cầu kĩ thuật và phương pháp thử

[4] TCVN 7157 (ISO 4799), Dụng cụ thí nghiệm bằng thủy tinh - Bộ ngưng tụ

[5] TCVN 7158 (ISO 4800), Dụng cụ thí nghiệm bằng thủy tinh - Phễu chiết và phễu chiết nhỏ giọt

[6] ISO 8655-2, Piston-operated volumetric apparatus - Part 2: Piston pipettes

[7] TCVN 6900-2 (ISO 78-2), Hóa học - Cách trình bày tiêu chuẩn - Phần 2: Phương pháp phân tích hóa học

[8] COI/T.20/Doc. No. 24:2001, Preparation of the fatty acid methyl esters from olive oil and olive- pomance oil

[9] CHRISTIE, W.W. Preparation of ester derivatives of fatty acids for chromatographic analysis. In: CHRISTIE, W.W., editor. Advances in lipid methodology - Two, pp. 69-111. Dundee: Oil Press, 1993

*) ISO 12966-4 hiện nay đang được biên soạn.