4. Nguyên tắc

Sau khi loại chất béo, mẫu da được xử lý bằng natri đithionit trong dung dịch kiềm ở 40 °C trong bình kín. 4-aminoazobenzen được giải phóng trong quá trình này, được chuyển đến pha t-butyl metyl ete bằng cách chiết lỏng/lỏng. Sử dụng một phần dung dịch ở pha tert-butyl metyl ete để phân tích.

Thực hiện việc phát hiện và xác định 4-aminoazobenzen bằng cách sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với detector mảng điot (DAD), hoặc detector chọn lọc khối lượng (HPLC/MS), sắc ký khí mao quản với detector chọn lọc-khối lượng (GC/MS) hoặc phương pháp điện di mao quản sử dụng detector mảng điot (CE/DAD), hoặc định tính bằng sắc ký lớp mỏng (TLC, HPTLC).

Nếu sử dụng một phương pháp sắc ký để phát hiện 4-aminoazobenzen, phải sử dụng thêm một hoặc nhiều hơn các phương pháp khác để xác nhận lại. Sử dụng phương pháp HPLC/DAD để thực hiện định lượng các amin.

5. Cảnh báo an toàn

5.1. Hợp chất 4-aminoazobenzen được phân loại là hợp chất được biết hoặc nghi ngờ là gây ung thư cho con người.

Khi vận chuyển và thải bỏ các chất này phải tuân thủ nghiêm ngặt quy định của quốc gia về an toàn sức khỏe thích hợp.

5.2. Đây là trách nhiệm của người sử dụng để sử dụng an toàn và chính xác các kỹ thuật trong việc vận chuyển vật liệu ở phương pháp thử này. Tham khảo nhà sản xuất đối với các chi tiết đặc biệt như bảng dữ liệu an toàn vật liệu và các khuyến nghị khác.

5.3. Tuân thủ thực hành phòng thí nghiệm tốt. Đeo kính bảo vệ trong phòng thí nghiệm và sử dụng mặt nạ chống bụi và găng tay sử dụng một lần khi làm việc với thuốc nhuộm dạng bột và 4-aminoazobenzen.

...

...

...

6. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ phòng thí nghiệm thông thường và các thiết bị, dụng cụ sau đây.

6.1. Bình phản ứng phù hợp, bằng thủy tinh chịu nhiệt có nắp đậy kín khí.

6.2. Nguồn nhiệt, sinh nhiệt độ (40 ± 2) °C.

6.3. Máy tách, có tốc độ quay hơn 3 000 r/min.

6.4. Máy cô quay bay hơi chân không.

6.5. Pipet, theo yêu cầu hoặc kích cỡ khác nhau.

6.6. Bể siêu âm, ít nhất 160 W, có bộ điều nhiệt.

6.7. Máy lắc ngang, với tần số phù hợp 5 s^-1, khoảng lắc từ 2 cm đến 5 cm.

...

...

...

6.9. Thiết bị

6.9.1. Sắc ký khí (GC), với detector chọn lọc khối lượng (MS).

6.9.2. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), giải hấp gradient và có detector mảng điot (DAD) hoặc detector chọn lọc khối lượng (MS).

6.9.3. Thiết bị sắc ký lớp mỏng (TLC), hoặc sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC), bao gồm bộ phát hiện thích hợp.

6.9.4. Điện di mao quản (CE) với DAD.

CHÚ THÍCH: Thiết bị được mô tả trong Phụ lục A.

7. Thuốc thử

Trừ khi có quy định khác, chỉ sử dụng các hóa chất loại phân tích.

7.1. Natri hyđroxit

...

...

...

7.3. Dung dịch natri hyđroxit, w = 2 %²

7.4. n-Hexan.

7.5. tert-Butyl metyl ete

7.6. Natri clorua

7.7. 4-aminoazobenzen, độ tinh khiết cao nhất.

7.8. Chuẩn nội đối với sắc ký khí (IS), ví dụ:

- IS1: naphtalen-d8 (Số CAS: 1146-65-2);

- IS2: 2,4,5-tricloanilin (Số CAS: 636-30-6);

- IS3: benzidin-d8 (Số CAS: 92890-63-6);

...

...

...

7.9. Các dung dịch chuẩn.

7.9.1. Dung dịch chuẩn nội (IS), trong tert-butyl metyl ete, r = 10,0 mg/ml

7.9.2. Dung dịch hiệu chuẩn 4-aminoazobenzen, 4-aminoazobenzen trong metanol, r = 500 mg/ml, để kiểm tra quy trình thử nghiệm và chuẩn bị các dung dịch hiệu chuẩn.

8. Lấy mẫu

Lấy mẫu theo TCVN 7117 (ISO 2418) và nghiền da theo TCVN 7126 (ISO 4044). Nếu không thể lấy mẫu theo quy định của TCVN 7117 (ví dụ trong trường hợp da được lấy từ các sản phẩm đã hoàn thiện như giầy, quần áo), thì chi tiết về việc lấy mẫu phải được nêu trong báo cáo thử nghiệm. Loại bỏ cơ học bất kỳ các vệt keo dính nào còn bám lại.

Trong trường hợp da được gắn với vải có họa tiết nhiều màu sắc, phải tách riêng các màu sắc khác nhau càng nhiều càng tốt. Đối với hàng hóa bao gồm các chất lượng da khác nhau, phải phân tích riêng từng chất lượng da.

9. Cách tiến hành

9.1. Loại chất béo

Xử lý nhiều hơn 1,0 g da đã được cắt thành các mảnh nhỏ (25 mm²) hoặc mẫu da đã được nghiền trong bình 50 ml đậy kín (6.1) với 20 ml n-hexan (7.4) trong bể siêu âm (6.6) ở nhiệt độ (40 ± 2) °C trong 20 min.

...

...

...

9.2. Khử

Cho 9 ml dung dịch natri hyđroxit (7.3) vào mẫu. Đậy chặt bình phản ứng và lắc mạnh bình. Da phải được thấm ướt hoàn toàn.

Tiếp theo, dùng xy lanh (6.8) cho thêm 1,5 ml dung dịch nước natri đithionit (7.2). Lắc mạnh mẫu và dung dịch khử và lập tức giữ bình ở (40 ± 2) °C trong thời gian chính xác 30 min. Sau đó làm mát xuống nhiệt độ phòng (20 °C đến 25 °C) trong 1 min bằng nước, hoặc nếu cần thiết bằng hỗn hợp lạnh gồm đá, nước và muối.

9.3. Tách và cô đặc 4-aminoazobenzen

Cho 5ml tert-butyl metyl ete (7.5) hoặc 5 ml dung dịch chuẩn nội (7.9.1) vào dung dịch phản ứng. Sau đó, thêm 7 g natri clorua (7.6) và lắc hỗn hợp liên tục trong 45 min; với tần số lắc ¦ = 5 s^-1 (6.7). Để tách pha hoàn toàn, ly tâm hỗn hợp sau khi lắc.

Thời gian nghỉ giữa việc làm mát và lắc không lâu hơn 5 min.

Đối với việc phân tích tiếp theo, lấy một phần dung dịch ở pha tert-butyl metyl ete vào một lọ nhỏ phù hợp và đậy nắp nhanh. Sử dụng thiết bị sắc ký được liệt kê trong 6.9 để thực hiện việc phát hiện và xác định 4-aminoazobenzen.

KHUYẾN NGHỊ - Đối với một số kỹ thuật phân tích, có thể cần phải cô đặc dịch chiết ở 9.3 hoặc chuyển sang dung môi thích hợp khác (ví dụ metanol). Nên cô đặc dịch chiết tert-butyl metyl ete đến khoảng 1 ml (chưa khô hẳn) bằng máy cô quay bay hơi chân không trong chân không nhẹ ở không quá 50 °C. Cẩn thận lấy phần dung môi còn lại bằng dòng khí trơ nhẹ, không dùng chân không.

CHÚ THÍCH 1: Việc lấy dung môi (cô đặc trong máy cô quay bay hơi chân không, bay hơi đến khô) có thể làm mất chất quan trọng 4-aminoazobenzen nếu không thực hiện dưới các điều kiện kiểm soát.

...

...

...

9.4. Dung dịch hiệu chuẩn

Cho 5 ml tert-butyl metyl ete (7.5) hoặc 5 ml dung dịch chuẩn nội (7.9.1) vào 100 ml dung dịch hiệu chuẩn 4-aminoazobenzen (7.9.2). Hỗn hợp này được sử dụng để hiệu chuẩn khi tỉ lệ thu hồi 4-aminoazobenzen bằng cách tách pha theo quy trình này đạt 95 % đến 100 %.

9.5. Kiểm tra hệ thống phân tích

Để kiểm tra quy trình, xử lý 100 ml dung dịch hiệu chuẩn 4-aminoazobenzen (7.9.2) theo 9.2 và 9.3. Tỉ lệ thu hồi 4-aminoazobenzen phải tối thiểu đạt 60 %.

9.6. Phân tích sắc ký

Việc phát hiện 4-aminoazobenzen có thể được thực hiện bằng sử dụng các thiết bị sắc ký được liệt kê trong 6.9. Cũng cho phép sử dụng các phương pháp được công nhận khác. Thực hiện định lượng 4-aminoazobenzen bằng phương pháp HPLC/DAD hoặc GC/MS; Sử dụng chuẩn nội phù hợp (7.8) khi sử dụng sắc ký khí.

10. Đánh giá

Hàm lượng 4-aminoazobenzen thường được tính toán bằng chương trình phần mềm. Cũng có thể tính toán thủ công từ diện tích các pic.

10.1. Tính toán với chuẩn nội

...

...

...

trong đó

r_c là nồng độ của 4-aminoazobenzen trong dung dịch hiệu chuẩn, tính bằng microgram trên mililít (mg/ml);

A_s là diện tích pic của 4-aminoazobenzen trong dung dịch mẫu thử, tính bằng đơn vị diện tích;

A_c là diện tích pic của 4-aminoazobenzen trong dung dịch hiệu chuẩn, tính bằng đơn vị diện tích;

A_ISS là diện tích pic của chuẩn nội trong dung dịch mẫu thử, tính bằng đơn vị diện tích3;

A_ISC là diện tích pic của chuẩn nội trong dung dịch hiệu chuẩn, tính bằng đơn vị diện tích4;

V là thể tích của mẫu thử theo 9.3 (thể tích mẫu thử cuối cùng), tính bằng mililit (ml); trường hợp này: 5 ml;

m_E là khối lượng của mẫu thử da, tính bằng gam (g).

...

...

...

Hàm lượng 4-aminoazobenzen được tính toán theo phần khối lượng, w, tính bằng miligam trên kilôgam (mg/kg) mẫu thử, theo công thức sau:

trong đó

r_c là nồng độ của 4-aminoazobenzen trong dung dịch hiệu chuẩn, tính bằng microgram trên mililít (mg/ml);

A_s là diện tích pic của 4-aminoazobenzen trong dung dịch mẫu thử, tính bằng đơn vị diện tích;

A_c là diện tích pic của 4-aminoazobenzen trong dung dịch hiệu chuẩn, tính bằng đơn vị diện tích;

V là thể tích của mẫu thử theo 9.3 (thể tích mẫu thử cuối), tính bằng mililít (ml); ở đây: 5 ml;

m_E là khối lượng của mẫu thử da, tính bằng gam (g).

10.3. Độ tin cậy của phương pháp

...

...

...

11. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải nêu phương pháp chính thức này và ít nhất bao gồm các thông tin sau:

a) viện dẫn tiêu chuẩn này;

b) loại, nguồn gốc và ký hiệu của mẫu thử (mẫu thử từng phần, nếu áp dụng);

c) ngày nhận và ngày phân tích mẫu;

d) quy trình lấy mẫu;

e) phương pháp phát hiện và phương pháp định lượng

f) kết quả được báo cáo dưới dạng hàm lượng và giới hạn phát hiện 4-aminoazobenzen, tính bằng miligam trên kilôgam (mg/kg). Giải thích rõ khi hàm lượng 4-aminoazobenzen thấp hơn 30 mg/kg (xem Phụ lục C).

...

...

...

(tham khảo)

Phân tích sắc ký

A.1. Nhận xét sơ bộ

Do máy móc, thiết bị (6.9) của phòng thí nghiệm có thể khác nhau, nên không có chỉ dẫn phù  hợp chung cho phép phân tích sắc ký. Các thông số dưới đây đã thử nghiệm thành công và được sử dụng.

A.2. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) (quy trình định lượng)

A.2.1. Sắc ký lỏng hiệu năng cao/detector mảng điot (HPLC/DAD)

Dung môi giải hấp 1:

metanol

Dung môi giải hấp 2:

...

...

...

Pha tĩnh:

 Zorbax SB-phenyl®5 (5 mm); (250 x 4,6) mm;

Tốc độ dòng:

(0,7 đến 1,0) ml/min;

Gradient:

 xem Bảng A.1

Bảng A.1 - Chương trình gradient

Thời gian

min

...

...

...

%

Dung môi giải hấp 2

%

0

0

100

5

10

90

...

...

...

10

90

27

68

32

29

100

0

...

...

...

30 °C;

Thể tích bơm mẫu

10,0 ml;

Bộ phát hiện:

DAD, máy quang phổ

Định lượng

tại 240 nm, 280 nm, 305 nm và 380 nm

A.2.2. Sắc ký lỏng hiệu năng cao/detector chọn lọc khối lượng (HPLC/DAD/MS)

Dung môi giải hấp 1:

...

...

...

Dung môi giải hấp 2:

amoni axetat trong 1 000 ml nước, 5 mmol, pH = 3,0

Pha tĩnh:

Zorbax Eclipse XDB C186(3,5 mm); (50 x 2,1) mm;

Tốc độ dòng

300 ml/min

Gradient

xem Bảng A.2

Bảng A.2 - Chương trình gradient

...

...

...

min

Dung môi giải hấp 1

%

Dung môi giải hấp 2

%

0

10

90

1,5

...

...

...

80

7,5

90

10

Nhiệt độ cột:

40 °C

Thể tích bơm mẫu

2,0 ml;

...

...

...

detector khối lượng bẫy ion và/hoặc mạch tứ cực, detector MS phân mảnh ion con MS và/hoặc kiểu quét; đối với bước sóng cho DAD, xem A.2.1.

Khí phun:  

Nitơ (được đóng chai/bộ sinh)

lon hóa:

API phun điện tử dương, buồng phân mảnh 120 V

A.3. Sắc ký khí mao quản (GC/MS) (quy trình định lượng)

Cột mao quản:

ZB-5-(Zebron)7, chiều dài: 30 m, đường kính trong: 0,25 mm, chiều dày màng: 0,25 mm

Hệ thống bơm:

...

...

...

Nhiệt độ buồng bơm

250 °C

Khí mang:

Heli

Chương trình nhiệt độ:

50 °C (3 min), 50 °C đến 280 °C (15 °C/min), 280 °C (6 min)

Thể tích bơm

1,0 ml, chia dòng 1:15

Bộ phát hiện:

...

...

...

A.4. Điện di mao quản (CE/DAD) (quy trình định lượng)

Trộn 200 ml dung dịch mẫu (9.3) với 50 ml HCI (c= 0,01 mol/l) và cho lọc qua màng lọc (0,2 mm). Dung dịch này được phân tích bằng phương pháp điện di vùng mao quản.

Mao quản 1:

56 cm, không phủ, đường kính trong 50 mm, với đường quang mở

Mao quản 2:

56 cm, được phủ bằng polyvinyl ancohol (PVA), đường kính trong 50 mm, với đường quang mở

Dung dịch đệm:

dung dịch đệm phosphat (c = 50) mmol/l), pH=2,5

Nhiệt độ cột:

...

...

...

Điện thế:

30 kV

Thời gian bơm:

4 s

Thời gian phun:

5 s

Bộ phát hiện:

DAD 214 nm, 254 nm, máy quang phổ.

A.5. Sắc ký lớp mỏng (TLC) (quy trình định lượng); HPTLC hoặc chỉ TLC đối với xác nhận bán định lượng

...

...

...

Bản (HPTLC):

Silica gel 60 với chỉ thị huỳnh quang F254, (20 x 10) cm

Thể tích thực hiện:

(2 đến 5) ml, được chấm một chấm

Dung môi động 1:

Clorofom/axit axetic (90 + 10) về thể tích

A.5.2.

...

...

...

Silica gel 60 với chỉ thị huỳnh quang F254, (20 x 20) cm

Thể tích thực hiện:

10,0 ml, được chấm theo đường thẳng

Dung môi động 2:

Clorofom/etyl axetat/axit axetic (60 + 30 +10) về thể tích

Dung môi động 3:

Clorofom/metanol (95 + 5) về thể tích

Dung môi động 2 và 3:

Liên tiếp không làm khô bản

...

...

...

Bộ phát hiện:

1. đèn tử ngoại (UV)

2. sau khi xử lý liên tiếp với thuốc thử 1 và 2, thời gian phản ứng khoảng 5 min

Thuốc thử 1:

0,1 % NaNO₂ trong HCI (c = 1 mol/l)

Thuốc thử 2:

0,2 % a-naphtanol trong KOH (c = 1 mol/l)

A.6. Ví dụ về sắc ký đồ và phổ

...

...

...

CHÚ DẪN

X

thời gian

Y

độ hấp thụ

1

chuẩn nội

2

4-aminoazobenzen

...

...

...

CHÚ DẪN

X

thời gian

Y

độ hấp thụ

Hình A.2 - Phổ GC/MS 70 eV và cấu trúc 4-aminoazobenzen

CHÚ DẪN

...

...

...

min

Y

mAU

1

DAD A, Sig = 240

2

4-aminoazobenzen

3

DAD B, Sig = 380

...

...

...

CHÚ DẪN

X

min

Y

mAU

Hình A.4 - Phổ HPLC/DAD của 4- aminoazobenzen

Phụ lục B

...

...

...

Độ tin cậy của phương pháp

Bảng B.1 chỉ ra các thử nghiệm liên phòng thí nghiệm thực hiện xác định 4-aminoazobenzen có trong da.

Bảng B.1 - Kết quả từ các thử nghiệm liên phòng - Xác định hàm lượng 4-aminoazobenzen được tạo thành trong da^[1]

Thông số

Quy trình phân tích

GC/MS

HPLC

Số phòng thí nghiệm tham gia

10

...

...

...

Số không tin cậy

2

2

Số phòng thí nghiệm sau khi loại trừ số không tin cậy

8

9

Giá trị trung bình, x, mg/kg

81,9

91,2

...

...

...

21,4

27,1

Độ lệch chuẩn của độ lặp lại, s_r, mg/kg

7,6

9,7

Độ tái lập, R, mg/kg

32,5

35,9

Độ lệch chuẩn của độ tái lập, s_R, mg/kg

...

...

...

12,5

Đây là phương pháp chính thức được phát triển bởi nhóm làm việc “Phân tích việc loại trừ thuốc nhuộm azo” của BVL Đức và được thử nghiệm vòng tròn với 11 thành viên.

a) Về việc đánh giá độ lặp lại và độ tái lập của các kết quả thử nghiệm vòng tròn, phải tính đến các điều sau:

1) Thử nghiệm vòng tròn đã chứng minh tỉ lệ thuốc nhuộm với tác nhân khử và thời hạn sử dụng tác nhân khử có thể có ảnh hưởng quyết định đến kết quả định lượng. Do đó, nên nghiêm ngặt thực hiện việc khử theo các điều kiện được mô tả trong 9.2 (thời gian, nhiệt độ và các khối lượng cụ thể).

2) Yếu tố quan trọng khác là chiết lỏng/lỏng, ví dụ sự tách lớp của dung dịch nước và pha hữu cơ nhằm tránh phản ứng tiếp theo của phân cắt liên kết azo của 4-aminoazobenzen. Do đó, nên quan sát nghiêm ngặt chính xác các điều kiện được mô tả trong 9.3.

b) Mẫu da cho thử nghiệm vòng tròn được lấy từ một sản phẩm điển hình, cắt và trộn với một mẫu da không màu. Do đó, tính đồng nhất của vật liệu có thể bị hạn chế.

c) Việc áp dụng các chuẩn nội tương ứng khác có thể dẫn đến độ tin cậy của quy trình GC/MSD cao hơn. Tuy nhiên, không được tính đến trong việc đánh giá thử nghiệm vòng tròn.

Phụ lục C

...

...

...

Hướng dẫn đánh giá - Giải thích kết quả phân tích

Do một lượng rất nhỏ các amin sinh ra có thể dẫn đến kết quả dương bị sai. Phụ lục XVII của Chỉ thị REACH số 1907/2006 xác định giá trị giới hạn là 30 mg/kg vật liệu mẫu. Giá trị này chỉ áp dụng cho vật liệu mẫu đồng nhất về chất nền và màu sắc, không áp dụng cho mẫu là hỗn hợp các thành phần không đồng nhất.

Nếu phát hiện được hàm lượng 4-aminoazobenzen trên 30 mg/kg, phải xác nhận là đã sử dụng thuốc nhuộm azo. Dưới 30 mg/kg, thì không thể kết luận việc sử dụng thuốc nhuộm azo nếu không có thông tin bổ sung như kiểu và/hoặc độ tinh khiết của thuốc nhuộm hoặc vật liệu thô khác được sử dụng.

Trong trường hợp này, nên báo cáo kết quả phân tích như sau:

Trong trường hợp mức 4-aminoazobenzen được tạo thành ≤ 30 mg/kg

- Theo phép phân tích thực hiện, 4-aminoazobezen có thể được thuốc nhuộm azo giải phóng ra bằng cách khử nhóm/các nhóm azo không được phát hiện trong hàng hóa được kiểm tra.

Trong trường hợp mức 4-aminoazobenzen được tạo thành > 30 mg/kg

- Theo phép phân tích thực hiện, hàng hóa được kiểm tra đã được sản xuất hoặc xử lý sử dụng thuốc nhuộm azo bị cấm theo Phụ lục XVII của Chỉ thị REACH 1907/2006.

...

...

...

[1] Amtliche Sammlung von Untersuchungsverfahren nach § 64 LFGB B 82.02-9:2006-09/BVL B82.02-9:2006-09 Berichtigung 2008-04 - Nachweis der Verwendung von Azofarbstoffen, die 4- aminoazobenzol freisetzen können

[2] Regulation (EC) No. 1907/2006 of the European Parliament and of the Council concerning the Registration, Evaluation, Authorisation and Restriction of Chemicals (REACH), Annex XVII.

1 r = nồng độ khối lượng

2 w = phần khối lượng (phần trăm khối lượng)

3 Đối với việc định lượng bằng phương pháp GC/MS.

4 Đối với việc định lượng bằng phương pháp GC/MS.

5 Zorbax SB-phenyl® là ví dụ về sản phẩm có giá trị thương mại. Thông tin này được đưa ra nhằm tạo thuận lợi cho người sử dụng tiêu chuẩn này và không phải là chỉ định của tiêu chuẩn.

6 Zorbax Eclipse XDB C18 là ví dụ về một sản phẩm có giá trị thương mại. Thông tin này được đưa ra nhằm tạo thuận lợi cho người sử dụng tiêu chuẩn này và không phải là chỉ định của tiêu chuẩn.

7 ZB-5-(Zebron) là ví dụ về một sản phẩm có giá trị thương mại. Thông tin này được đưa ra nhằm tạo thuận lợi cho người sử dụng tiêu chuẩn này và không phải là chỉ định của tiêu chuẩn.