Sau khi toàn bộ dịch lọc chảy qua cột SPE, tráng cột bằng 5 ml nước và loại bỏ dịch rửa giải. Làm khô cột bằng cách hút chân không đến khi không còn dịch rửa giải chảy ra rồi khóa van.

Đặt bình định mức 5 ml hoặc 10 ml (4.9) phía dưới cột. Thêm 4,4 ml axetonitril 25 % (3.13) vào các cột SPE 600 mg và 4,4 ml axetonitril 30 % (3.14) vào các cột SPE 900 mg. Mở van khóa và cho nước rửa giải vitamin B₁₂ vào các bình định mức.

Sự pha loãng cuối cùng là:

Đối với dịch lọc mẫu đựng trong bình định mức 10 ml, pha loãng bằng nước đến vạch.

Đối với dịch lọc mẫu đựng trong bình định mức 5 ml, đưa vào tủ hút (4.17) và thêm 0,1 ml dung dịch kali xyanua 0,4 % (3.5) mới chuẩn bị.

Đặt các bình định mức vào tủ sấy (4.4) ở 95 ^oC trong ít nhất 1,5 h và không quá 4h, sau đó lấy bình ra và làm nguội đến nhiệt độ phòng. Pha loãng bằng nước đến vạch. Lọc các lượng chứa trong bình định mức qua màng lọc 0,45 mm (4.14) vào lọ đựng mẫu (4.16).

6.4 Phân tích bằng HPLC

6.4.1 Cài đặt hệ thống

Cài đặt cấu hình của hệ thống theo Hình 1 và Hình 2.

...

...

...

Hình 1 - Cấu hình 1

Hình 2 - Cấu hình 2

6.4.2 Điều kiện vận hành thiết bị

a) Thời gian chạy: 30 min;

b) Thể tích bơm: 2,0 ml;

c) Cấu hình của hệ thống: theo quy định trong Bảng 2.

Bảng 2 - Cấu hình của hệ thống

Thời gian, min

Cấu hình của van

...

...

...

Cấu hình 1

Từ 10,5 đến 14,5

Cấu hình 2

Từ 14,5 đến 30,0

Cấu hình 1

d) Bơm đẳng dòng

- pha động D: Dung dịch axetonitril 2,5 % (3.11);

- tốc độ dòng: điển hình từ 1,1 ml/min đến 1,2 ml/min; điều chỉnh sao cho dịch rửa giải vitamin B₁₂ chảy từ cột rây phân tử trong thời gian từ 10,5 min đến 14,5 min.

CHÚ THÍCH: Để xác định tốc độ dòng thích hợp, nối trực tiếp cột rây phân tử với detector UV-Vis và bơm dung dịch chuẩn đi qua. Chỉnh tốc độ dòng sao cho dịch rửa giải vitamin B₁₂ chảy từ cột rây phân tử trong thời gian từ 10,5 min đến 14,5 min.

...

...

...

Thành phần dung môi pha động:

- dung môi pha động A (3.8);

- dung môi pha động B (3.9);

- dung môi pha động C (3.10).

Gradient để rửa giải vitamin B₁₂ trong 20 min đến 25 min: xem Bảng 3.

Bảng 3 - Gradient của cột C18

Thời gian, min

Pha động, %

A

...

...

...

C

0,00

90

10

0

14,5

90

10

0

...

...

...

41

59

0

26,0

41

59

0

26,1

0

...

...

...

90

28,0

0

10

90

Tốc độ dòng: 1,0 ml/min.

f) Cài đặt detector

- bước sóng phát hiện: 550nm;

- băng thông: 10 nm.

...

...

...

Bơm dung dịch chuẩn làm việc (3.16.3) từ 3 lần đến 4 lần, độ chính xác của mỗi lần bơm £ 3 %.

Nếu hệ thống hoạt động tốt, bơm lần lượt một dãy từ 3 đến 6 dung dịch chuẩn làm việc (3.16.3), một mẫu kiểm soát, một dãy từ 1 đến 14 dung dịch mẫu thử và một dãy từ 3 đến 6 dung dịch chuẩn làm việc khác. Mỗi dãy dung dịch mẫu thử cần được sắp xếp tương ứng với các dung dịch chuẩn có nồng độ thích hợp.

6.5 Dựng đường chuẩn

Với mỗi nồng độ chất chuẩn, tính giá trị trung bình của diện tích pic của chất chuẩn được bơm đầu tiên và diện tích pic của chất chuẩn được bơm cuối cùng trong dãy mẫu. Dựng đường chuẩn tuyến tính bằng phương pháp bình phương nhỏ nhất của nồng độ chất chuẩn theo diện tích pic trung bình của các dung dịch chuẩn làm việc.

Đường chuẩn phải có hệ số tương quan ít nhất là 0,999.

Với mỗi nồng độ của dung dịch chuẩn làm việc, diện tích pic của chất chuẩn được bơm đầu tiên và diện tích pic của chất chuẩn được bơm cuối cùng không được dao động quá 10 %.

7. Tính kết quả

Kiểm tra sắc kí đồ của dung dịch chuẩn và dung dịch mẫu thử và kiểm tra độ phân giải của vitamin B­₁₂ của các pic trên sắc kí đồ (xem Phụ lục A).

Tính diện tích pic vitamin B₁₂. Cần đảm bảo rằng diện tích pic của dung dịch mẫu thử nằm trong dải diện tích pic của các dung dịch chuẩn làm việc.

...

...

...

X =

Trong đó:

C_i là nồng độ vitamin B₁₂ trong dung dịch mẫu thử được bơm vào thiết bị HPLC (xem 6.4.3), được xác định từ đường chuẩn, tính bằng microgram trên lít (mg/l);

D­₁ là thể tích dung dịch pha loãng thứ nhất, tính bằng mililit (D₁ = 100 ml);

D₂ là thể tích dung dịch pha loãng cuối cùng, tính bằng mililit (ml);

V là thể tích dịch lọc được đưa lên cột SPE, tính bằng mililit (ml);

w là khối lượng mẫu, tính bằng gam (g).

8. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm các thông tin sau:

...

...

...

b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

c) phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) mọi chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc được xem là tùy chọn, cùng với mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả;

e) kết quả thử nghiệm thu được.

Phụ lục A

(Tham khảo)

Dữ liệu về kết quả đánh giá xác nhận phương pháp

Dữ liệu về kết quả đánh giá xác nhận phương pháp trên các nền mẫu thức ăn công thức cho trẻ sơ sinh và sản phẩm dinh dưỡng được nêu trong Bảng A.1

...

...

...

Mẫu

Phương pháp HPLC

Giá trị trung bình của phương pháp vi sinh, mg/kg

Tỉ lệ giá trị trung bình của phương pháp HPLC so với phương pháp vi sinh, %

Số lượng mẫu

Giá trị trung bình, mg/kg

Độ lệch chuẩn tương đối, %

Thức ăn công thức không chứa chất gây dị ứng, dạng bột

12

...

...

...

4,00

53,6

95,9

Thức ăn công thức từ đậu nành, dạng bột

15

47,8

5,30

48,5

98,6

...

...

...

12

59,5

5,19

61,2

97,2

Thức ăn công thức từ sữa, dạng lỏng

9

4,30

4,42

...

...

...

102

Thức ăn công thức không chứa lactoza, dạng bột

12

42,9

4,70

45,6

94,1

Thức ăn dinh dưỡng cho trẻ nhỏ

9

...

...

...

5,27

7,80

90,2

Thức ăn dinh dưỡng cho người lớn

12

51,7

5,66

47,6

109

...

...

...

21

11,2

4,85

10,8

104

Bột dinh dưỡng đã chuyển hóa, dành cho trẻ nhỏ/người lớn

9

48,0

8,88

...

...

...

97,0

Đồ uống dinh dưỡng cho người lớn bị bệnh đái đường

9

21,7

0,76

23,2

93,5

Bột dinh dưỡng đã chuyển hóa cho trẻ nhỏ/người lớn

14

...

...

...

4,85

87,7

102

Đồ uống dinh dưỡng với mục đích chữa bệnh cho người lớn

9

16,6

5,10

18,3

90,7

...

...

...

Phụ lục B

(Tham khảo)

Sắc kí đồ điển hình

Hình B.1 - Ví dụ 1

Hình B.2 - Ví dụ 2

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

...

...

...