7.6.2. Tính các độ hấp thụ

7.6.2.1. Nếu sau 15 min ủ mà độ hấp thụ không tăng thì tính độ hấp thụ A của lượng chứa trong từng cuvet để sử dụng trong phép tính (xem 8.1), dùng công thức sau:

A = A_t - A₀                                                         (1)

Trong đó:

A₀ là độ hấp thụ đo được trước khi thêm huyền phù b-galactosidaza dehydrogenaza;

A₁ là độ hấp thụ đo được sau khi ủ trong khoảng thời gian 15 min.

7.6.2.2. Nếu sau 15 min mà phản ứng vẫn chưa dừng thì tính độ hấp thụ A của lượng chứa trong từng cuvet để sử dụng trong phép tính (xem 8.1), dùng công thức sau:

A = (A_t – A₀) - (A_t - A_t-5)                                                (2)

Trong đó:

...

...

...

A_t là độ hấp thụ đo được sau khi ủ trong khoảng thời gian t min;

A_(t-5) là độ hấp thụ đo được sau khi ủ trong khoảng thời gian (t-5) min.

7.6.3. Kiểm tra xác nhận

Nếu độ hấp thụ A vượt quá 0,500 thì lặp lại quy trình quy định trong 7.6.1 và 7.6.2, sử dụng dung dịch pha loãng thích hợp của dịch lọc (7.5.2).

8. Tính và biểu thị kết quả

8.1. Tính

Hàm lượng lactoza, w_L tính được theo công thức sau:

w_L =

Trong đó:

...

...

...

A₁ là độ hấp thụ (tính được trong 7.6.2) của phép thử mẫu hoặc chất chuẩn về lactoza và galactoza;

A₂ là độ hấp thụ (tính được trong 7.6.2) của phép thử mẫu hoặc chất chuẩn về galactoza;

A₃ là độ hấp thụ (tính được trong 7.6.2) của phép thử mẫu trắng về lactoza và galactoza;

A₄ là độ hấp thụ (tính được trong 7.6.2) của phép thử mẫu trắng về galactoza;

M_r là khối lượng phân tử của lactoza, đối với lactoza dạng khan thì M_r = 342,30 và lactoza ngậm một phân tử nước thì M_r = 360,31;

K là hệ số hấp thụ phân tử của NADPH ở bước sóng 340 nm (K = 6,3 x 10 ⁶ cm²/mol);

l là chiều dài đường quang lý thuyết của cuvet đo phổ, tính bằng centimet (1 cm);

V₁ là tổng thể tích của chất lỏng trong cuvet đo phổ (7.6.1), tính bằng mililit (3,30 ml);

V₂ là thể tích dịch lọc (7.5.2) hoặc dung dịch pha loãng của dịch lọc (7.6.3) được cho vào cuvet đo phổ (1,00 ml), tính bằng mililit (ml);

...

...

...

V₄ là thể tích của dịch lọc (7.5.2) được lấy để pha loãng (7.6.3), tính bằng mililit (ml);

V₅ là thể tích dung dịch thử được lấy để pha loãng (7.6.3), tính bằng mililit (ml);

m là khối lượng phần mẫu thử (7.3), tính bằng gam (g).

Nếu giá trị (A₂ - A₄) là giá trị âm thì mới được tính đến.

CHÚ THÍCH: Nếu khối lượng phần mẫu thử lớn hơn 1 g thì thể tích có thể được tính như sau:

V₃ = 100 - P

Trong đó P là thể tích phần kết tủa, tính bằng mililit. Có thể tính giá trị P từ thành phần gần đúng của phần mẫu thử theo công thức:

P = 1,1 x (gam chất béo) + 0,73 x (gam protein) + 0,65 x (gam tinh bột) + 0,55 x (gam tro hòa tan).

8.2. Biểu thị kết quả

...

...

...

9. Độ chụm

9.1. Phép thử liên phòng thử nghiệm

Các chi tiết về phép thử liên phòng thử nghiệm về độ chụm của phương pháp được công bố trong 6.

Các giá trị về độ lặp lại và độ tái lập thu được từ phép thử liên phòng thử nghiệm này được xác định phù hợp với TCVN 6910-2 (ISO 5725-2). Các giá trị thu được từ phép thử liên phòng thử nghiệm này có thể không áp dụng được cho dải nồng độ và chất nền khác với các dải nồng độ và chất nền đã nêu.

CHÚ THÍCH: IDF 135 đưa ra các hướng dẫn chi tiết về các phép thử liên phòng quốc tế đối với các phương pháp phân tích và các sản phẩm sữa. Hướng dẫn này được dựa vào TCVN 6910 (ISO 5725).

9.2. Độ lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử độc lập, riêng rẽ thu được, khi sử dụng cùng một phương pháp, trên cùng một loại vật liệu thử, trong cùng phòng thử nghiệm, do cùng một người thao tác và sử dụng cùng một thiết bị trong cùng một khoảng thời gian ngắn như nhau, không được quá 5 % trường hợp vượt quá các giá trị sau:

- đối với sữa bột và hỗn hợp kem lạnh dạng bột: 3 % trung bình của các kết quả;

- đối với phomat chế biến: 6 % trung bình của các kết quả.

...

...

...

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử độc lập, riêng rẽ thu được, khi sử dụng cùng một phương pháp, trên cùng một loại vật liệu thử, trong các phòng thử nghiệm khác nhau, do những người thao tác khác nhau thực hiện và sử dụng các thiết bị khác nhau, không được quá 5 % các trường hợp vượt quá các giá trị sau:

- đối với sữa bột và hỗn hợp kem lạnh dạng bột: 6 % trung bình của các kết quả;

- đối với phomat chế biến: 14 % trung bình của các kết quả.

10. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

a) mọi thông tin cần thiết về việc nhận biết đầy đủ mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

c) viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) mọi chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc được cho là tùy chọn, cùng với các chi tiết bất thường khác có thể ảnh hưởng tới kết quả;

...

...

...

Phụ lục A

(Quy định)

Các nguyên tắc về Thực hành phòng thử nghiệm tốt (GLP) để tiến hành các phép phân tích enzym

A.1. Giới thiệu

Các nguyên tắc về Thực hành phòng thử nghiệm tốt (GLP) để tiến hành các phép phân tích enzym thông thường ít được biết đến hơn so với các phép phân tích hóa học.

Đặc biệt chú ý đến các nguyên tắc để thu được các kết quả chính xác và độ chụm thích hợp.

Do đó, trước khi phân tích cần đọc kỹ các nguyên tắc về Thực hành phòng thử nghiệm tốt (GLP) để tiến hành các phép phân tích enzym nêu dưới đây.

A.2. Thuốc thử

...

...

...

A.2.2. Chỉ sử dụng các coenzym quy định (loại tinh khiết, dạng muối hoặc axit, chất nhiễm bẩn).

A.2.3. Tất cả các thuốc thử không kết enzym và coenzym phải là loại tinh khiết phân tích.

A.2.4. Nước dùng để pha chế các dung dịch enzym và các thuốc thử khác phải là nước được cất hai lần bằng dụng cụ thủy tinh.

A.2.5. Nước dùng để pha chế các dung dịch mẫu phải là nước được cất bằng dụng cụ thủy tinh hoặc đã loại ion.

A.2.6. Bảo quản các thuốc thử, các dung dịch/huyền phù enzym theo chỉ dẫn (thường khoảng từ 2 °C đến 8 °C).

A.2.7. Không làm đông lạnh các huyền phù enzym.

A.2.8. Khi đã quá hạn sử dụng của các loại thuốc thử thì phải loại bỏ hoặc kiểm tra hiệu quả của thuốc thử bằng cách kiểm tra các dung dịch chuẩn có các hàm lượng chất phân tích khác nhau. Các độ hấp thụ thu được phải tỷ lệ thuận với các nồng độ.

A.2.9. Các dung dịch đệm được lấy ra từ tủ lạnh phải được làm ấm đến nhiệt độ phòng trước khi bổ sung vào các hỗn hợp phân tích.

A.3. Cuvet đo quang và cuvet đo phổ

...

...

...

CHÚ THÍCH: Các cuvet bằng chất dẻo có các ưu điểm hơn so với cuvet thủy tinh như sau:

- rẻ (dùng một lần);

- có thể tiến hành nhiều phép phân tích hơn;

- trong một mẻ, các cuvet bằng chất dẻo cho độ hấp thụ thống nhất với nhau.

A.3.2. Mỗi khi đưa một mẻ cuvet mới vào sử dụng, cần kiểm tra chiều dài đường quang của cuvet chính xác (ví dụ: cuvet thạch anh) như sau:

Đổ đầy nước vào cuvet chính xác và các cuvet bằng chất dẻo rồi đo độ hấp thụ (A₁) của từng cuvet dựa vào không khí. Sau khi tráng rửa, đổ đầy dung dịch NADH (khoảng 0,15 mg/ml) và đo lại độ hấp thụ (A₂) dựa vào không khí.

Đối với cả hai cuvet chính xác và cuvet bằng chất dẻo, tính (A₂ - A₁). Chênh lệch (A₂ - A₁) giữa hai loại cuvet phải không đáng kể. Nếu chênh lệch (A₂ - A₁) vượt quá 0,5 % của giá trị hấp thụ thực đối với cuvet chính xác thì tính độ chênh lệch trung bình theo phần trăm và cần tính đến giá trị này đối với chiều dài đường quang, l, trong phần tính kết quả (xem 8.1).

A.3.3. Luôn sử dụng cuvet sạch và không có vết xước. Làm khô hoặc lau sạch bên ngoài cuvet bằng khăn mềm.

A.3.4. Không đo độ hấp thụ của cuvet mẫu thử dựa theo độ hấp thụ của cuvet thử trắng, vì sẽ không thu được thông tin về cường độ hấp thụ của phép thử mẫu trắng. Đo độ hấp thụ của cả hai mẫu thử và cuvet mẫu trắng dựa vào không khí và tính độ chênh lệch.

...

...

...

A.3.6. Dùng que khuấy bằng chất dẻo để trộn lượng chứa trong cuvet hoặc đậy kín cuvet bằng parafin rồi xoay nhẹ cuvet.

A.3.7. Sử dụng que khuấy để loại bọt khí ra khỏi thành cuvet. Tránh làm xước thành cuvet.

A.3.8. Luôn sử dụng cùng một loại cuvet để đo mẫu thử và phép thử mẫu trắng.

A.3.9. Luôn đặt các cuvet theo cùng tư thế và cùng hướng trong giá đỡ cuvet. Đối với mục đích này, đánh dấu một mặt của cuvet quang học.

A.4. Máy đo quang và máy đo phổ

A.4.1. Sử dụng máy đo phổ (chiều rộng dải £ 10 nm), có trang bị bộ lọc nhiễu (chiều rộng dải £ 10 nm) hoặc máy đo quang phổ, được trang bị đèn hơi thủy ngân. Các phép đo sử dụng máy đo phổ hoặc máy đo quang có bộ lọc, phải được thực hiện ở độ hấp thụ tối đa của NADH hoặc NADPH, nghĩa là ở bước sóng 340 nm, còn các phép đo sử dụng máy đo quang có đèn hơi thủy ngân phải được thực hiện ở 365 nm hoặc 334 nm.

CHÚ THÍCH: Các hệ số hấp thụ phân tử của NADH và NADHP được đo ở bước sóng 334 nm, 340nm và 365 nm như sau:

- NADH và NADHP ở bước sóng 334 nm (Hg): 6,18 x 10⁶ cm²/mol;

- NADH và NADHP ở bước sóng 340 nm: 6,3 x 10⁶ cm²/mol;

...

...

...

- NADH ở bước sóng 365 nm (Hg): 3,4 x 10⁶ cm²/mol;

A.4.2. Giữa độ hấp thụ và nồng độ của NADH hoặc NADPH phải có mối quan hệ tuyến tính đến độ giá trị 2,0. Kiểm tra như sau:

a) Dùng pipet lấy 2,00 ml nước cất cho vào cuvet. Đo độ hấp thụ A₀ so với không khí.

b) Dùng pipet lấy 0,10 ml dung dịch NADH (0,5 mg/ml) cho vào cuvet và trộn. Đo độ hấp thụ A₁.

Tính độ hấp thụ giảm, A_r1, theo công thức sau:

A_r1 = (A_t - A₀) x

Trong đó:

A₁ là độ hấp thụ thu được trong phép đo dung dịch NADH (b);

A₀ là độ hấp thụ thu được trong phép đo của nước (a);

...

...

...

Sau mỗi cặp phép đo, tính sự giảm của độ hấp thụ, A_m, theo công thức sau:

A_m = (A_n - A₀) x

Trong đó:

A_n là độ hấp thụ thu được tại phép đo thứ n;

V là thể tích lượng chứa trong cuvet tại phép đo thứ n.

d) Đối với mỗi phép đo, vẽ đồ thị của thể tích dung dịch NADH có trong cuvet theo các độ hấp thụ giảm tương ứng. Đường đi qua các điểm giao nhau phải là đường thẳng.

A.5. Pipet tự động và các bộ phân phối khác

A.5.1. Sử dụng các pipet tự động và các bộ phân phối khác theo chỉ dẫn của nhà sản xuất.

A.5.2. Sử dụng các đầu tip thích hợp cho mỗi loại pipet.

...

...

...

a) cân cốc thủy tinh có mỏ với nước ở thời điểm t;

b) dùng pipet hoặc bộ phân phối đong nước cho vào cốc có mỏ và cân chính xác ở thời điểm t + 1 min sau khi cân lần thứ nhất;

c) lặp lại chín lần quy trình sử dụng pipet hoặc bộ phân phối như trong b);

d) cân cốc có mỏ tại các thời điểm t + 11 min, t + 12 min, t + 13 min, t + 14 min và t + 15 min không có pipet hoặc bộ phân phối, tính hao hụt khối lượng do bay hơi trên một phút giữa các lần cân này;

e) tính thể tích và độ lặp lại của pipet hoặc bộ phân phối, có tính đến hao hụt khối lượng do nước bị bay hơi.

A.5.4. Thể tích của một số pipet tự động có thể bị ảnh hưởng bởi sự truyền nhiệt từ lòng bàn tay khi sử dụng lâu.

Kiểm tra hiện tượng này bằng quy trình trong A.5.3 và tránh sử dụng các pipet này.

A.5.5. Ngay trước khi sử dụng, tráng đầu tip của pipet vài lần bằng dung dịch/huyền phù cần được lấy. Đối với mỗi dung dịch mẫu, sử dụng một đầu tip mới.

A.5.6. Dùng pipet lấy nước, dung dịch đệm, enzym, coenzym và dung dịch mẫu (nhúng đầu tip càng thấp càng tốt) vào các góc khác nhau của cuvet.

...

...

...

A.5.7. Tránh nhiễm bẩn.

A.6. Thông tin bổ sung

A.6.1. Kiểm tra về các khả năng gây nhiễu và về sai số tổng thể bằng cách xác định các độ hấp thụ của hai dung dịch có các nồng độ khác nhau của chất phân tích. Các độ hấp thụ thu được phải tỷ lệ với nồng độ của chất phân tích.

A.6.2. Sử dụng chất chuẩn để kiểm tra các phản ứng enzym. Chất chuẩn này là chuẩn làm việc.

CHÚ THÍCH: Các chuẩn đối chứng có độ tinh khiết xác nhận có thể có được từ các Viện chuẩn quốc gia.

A.6.3. Tiến hành phép thử độ thu hồi khi có mặt của dung dịch mẫu. Lượng chất phân tích được bổ sung phải gần bằng lượng có mặt trong dung dịch mẫu.

A.6.4. Sử dụng một que khuấy cho mỗi cuvet hoặc dùng que khuấy sử dụng một lần.

CHÚ THÍCH: Lượng chất lỏng còn lại trên que khuấy phải được coi như không đáng kể.

...

...

...

[1] TCVN 6400 (ISO 707), Sữa và sản phẩm sữa - Hướng dẫn lấy mẫu

[2] TCVN 6910-1 (ISO 5725-1), Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo - Phần 1: Nguyên tắc và định nghĩa chung

[3] TCVN 6910-2 (ISO 5725-2), Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo - Phần 2: Phương pháp cơ bản xác định độ lặp lại và độ tái lập của phương pháp đo tiêu chuẩn

[4] IDF 135B:1991, Milk and milk products - Precision characteristics of analytical methods - Outline of collaborative study procedure

[5] Comité de Nomenclature de I’Union Internationale de Biochimie, Recommandations en matière de Nomenclature des Enzymes. Academic Press, New York, 1984

[6] Interlaboratory Collaborative Studies, second series. Bulletin International Dairy Federation, 285, 1993, annex A, annex B and annex C

1) Bộ kit thử Boehringer là một ví dụ về sản phẩm có bán sẵn trên thị trường. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn, còn tiêu chuẩn này không ấn định phải sử dụng chúng.

2) Ultra Turrax là một ví dụ về sản phẩm có bán sẵn trên thị trường. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn, còn tiêu chuẩn này không ấn định phải sử dụng chúng.