Detector huỳnh quang: bước sóng kích thích 490 nm và bước sóng phát xạ 520 nm;

Tốc độ dòng thuốc thử tạo dẫn xuất sau cột: 1 ml/min.

CHÚ THÍCH: Quy trình này cũng có thể được sử dụng để đánh giá d-biocytin.

7. Tính kết quả

Thực hiện phép xác định bằng ngoại chuẩn, tích phân diện tích pic hoặc chiều cao pic và sử dụng đường chuẩn bậc hai.

Tính phần khối lượng, w, của d-biotin, bằng mg/100 g mẫu, theo công thức (1) sau đây:

(1)

Trong đó:

...

...

...

V_e là thể tích dung dịch mẫu thử (6.2), tính bằng mililit (ml);

m_s là khối lượng mẫu, tính bằng gam (g);

100 là hệ số để tính hàm lượng trên 100 g;

8. Độ chụm

8.1. Yêu cầu chung

Dữ liệu về độ chụm của phương pháp HPLC này về xác định d-biotin được thiết lập năm 2000 từ phép thử cộng tác của Pháp, do CGd'UMA (Commission Générale d'Unification des Méthodes d'Analyses) tổ chức, xem [3], phù hợp với TCVN 6910-2 (ISO 5725-2), [1]. Các đường chuẩn được tất cả các bên tham gia sử dụng được tính từ ba điểm hiệu chuẩn. Các thông tin thống kê được nêu trong Phụ lục B.

8.2. Độ lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử riêng rẽ, thu được khi tiến hành trên vật liệu thử giống hệt nhau, do một người thực hiện sử dụng cùng thiết bị, trong một khoảng thời gian ngắn, không được quá 5 % các trường hợp vượt quá giới hạn lặp lại r.

Các giá trị đối với d-biotin là:

...

...

...

 = 197 mg/100g

r = 25,1 mg/100g

Sữa bột dành cho trẻ sơ sinh:

 = 16,0 mg/100g

r = 5,24 mg/100g

Nước cam có bổ sung vi chất:

 = 40,7 mg/100g

r = 2,51 mg/100g

Bột nghiền đậu Hà Lan với dăm bông được làm đông khô:

...

...

...

r = 8,99 mg/100g

Xúp gà đông khô:

 = 168 mg/100g

r = 19,4 mg/100g

8.3. Độ tái lập

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử riêng rẽ, thu được trên một vật liệu thử giống hệt nhau, do hai phòng thử nghiệm khi tiến hành, không được quá 5 % các trường hợp vượt quá giới hạn tái lập R.

Các giá trị đối với d-biotin là:

Bột ngũ cốc ăn nhanh:

 = 197 mg/100g

...

...

...

Sữa bột dành cho trẻ sơ sinh:

 = 16,0 mg/100g

R= 13,5 mg/100g

Nước cam có bổ sung vi chất:

 = 40,7 mg/100g

R = 22,8 mg/100g

Bột nghiền đậu Hà Lan với dăm bông được làm đông khô:

 = 88,9 mg/100g

R = 44,1 mg/100g

...

...

...

 = 168 mg/100g

R = 69,5 mg/100g

9. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ ít nhất các thông tin sau đây:

a) Mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử (loại mẫu, nguồn gốc xuất xứ, tên gọi);

b) viện dẫn tiêu chuẩn này;

c) ngày và phương pháp lấy mẫu đã sử dụng (nếu biết);

d) ngày nhận mẫu;

e) ngày thử nghiệm:

...

...

...

g) mọi chi tiết đặc biệt quan sát được trong khi thử nghiệm;

h) mọi chi tiết không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc tùy chọn có thể ảnh hưởng đến kết quả.

Phụ lục A

(Tham khảo)

Sắc ký đồ điển hình

CHÚ DẪN:

X là thời gian, tính bằng phút (min)

...

...

...

1 d-biotin

2 d-biocytin

Hình A.1 - Ví dụ về tách bằng HPLC đối với các chất chuẩn d-biotin và d-biocytin có tạo dẫn xuất sau cột

Các điều kiện thực nghiệm nêu trong Hình A.1 là:

Pha tĩnh:

Lichrospher^Ò 100 RP-18, cỡ hạt 5 mm, kích thước 250 mm x 4,0 mm;

Pha động:

8 thể tích dung dịch đệm phosphat pH = 6,0 (4.2.15) và 2 thể tích metanol (4.2.1);

Tốc độ dòng:

...

...

...

Thể tích bơm:

30 ml;

Detector huỳnh quang: bước sóng kích thích 490 nm và bước sóng phát xạ 520 nm;

Tốc độ dòng thuốc thử (tạo dẫn xuất sau cột): 1 ml/min.

CHÚ DẪN:

X là thời gian, tính bằng phút (min)

Y là cường độ huỳnh quang

1 d-biotin

...

...

...

Các điều kiện thực nghiệm nêu trong Hình A.2 là:

Pha tĩnh:

Lichrospher^Ò 100 RP-18, cỡ hạt 5 mm, kích thước 250 mm x 4,0 mm;

Pha động:

8 thể tích dung dịch đệm phosphat pH = 6,0 (4.2.15) và 2 phần thể tích metanol (4.2.1);

Tốc độ dòng:

0,4 ml/min;

Thể tích bơm:

30 ml;

...

...

...

bước sóng kích thích 490 nm và bước sóng phát xạ 520 nm;

Tốc độ dòng thuốc thử (tạo dẫn xuất sau cột): 1 ml/min.

Phụ lục B

(Tham khảo)

Dữ liệu về độ chụm

Các dữ liệu sau đây thu được trong một nghiên cứu liên phòng thử nghiệm do CGd'UMA (Commission Générale d'Unification des Méthodes d'Analyses) tổ chức năm 2000, xem [3] và [8]. Phép thử này được thực hiện phù hợp với TCVN 6910-2 (ISO 5725-2) [1]. Các đường chuẩn được tất cả các bên tham gia sử dụng được tính từ ba điểm hiệu chuẩn.

Bảng B.1 - Dữ liệu về độ chụm đối với bột ngũ cốc ăn nhanh, sữa bột dành cho trẻ sơ sinh, nước cam có bổ sung vi chất, hạt đậu xanh phủ muối đông khô, xúp gà đông khô

Mẫu

...

...

...

Sữa bột dành cho trẻ sơ sinh

Nước cam có bổ sung vi chất

Bột nghiền đậu Hà Lan với dăm bông được làm đông khô

Xúp gà đông khô

Năm thử nghiệm

2000

2000

2000

2000

...

...

...

Số lượng phòng thử nghiệm

10

10

10

10

10

Số lượng mẫu

2

2

...

...

...

2

2

Số phòng thử nghiệm còn lại sau khi trừ ngoại lệ

10

9

10

10

10

Số lượng phòng ngoại lệ

...

...

...

1

0

0

0

Số lượng kết quả được chấp nhận

20

18

20

20

...

...

...

Giá trị trung bình,  (mg/100 g)

197

16,0

40,7

88,9

168

Độ lệch chuẩn lặp lại s_r (mg/100 g)

8,85

1,85

...

...

...

3,18

6,84

Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, RSD_r,%

4,5

11,6

2,2

3,6

4,1

Giới hạn độ lặp lại, r (r = 2,8 x s_r) (mg/100 g)

...

...

...

5,24

2,51

8,99

19,4

Độ lệch chuẩn tái lập, s_R (mg/100 g)

34,2

4,76

8,05

15,6

...

...

...

Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, RSD_R, %

17,4

29,8

19,8

17,5

14,6

Giới hạn tái lập, R (R = 2,8 x s_R) (mg/100 g)

96,7

13,5

...

...

...

44,1

69,5

Giá trị Horrat [8]

1,2

1,4

1,1

1,1

1,0

...

...

...

[1] TCVN 6910-2 (ISO 5725-2) Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo - Phần 2: Phương pháp cơ bản xác định độ lặp lại và độ tái lập của phương pháp đo tiêu chuẩn

[2] Lahély, S., Ndaw, S., Arella, F., Hasselmann, C.: Determination of biotin in foods by high-performance liquid chromatography with post-column derivatization and fluorimetric detection. Food chem., 65, 253-258 (1999)

[3] Arella, F., Deborde, J.L, Bourguignon, J.B., Bergaentlze, M., Ndaw, S., Hasselmann, C.: Liquid chromatographic determination of biotin in foods. A collaborative study. Ann. Fals. Exp. Chim., 93, 951, 193-200 (2000).

[4] Hentz, N.G., Bachas, L.G.: Class-selective detection systems for liquid chromatography based on the streptavidin-biotin interaction. Anal. Chem., 67, 1014-1018 (1995)

[5] Przyjazny, A., Hentz, N.G., Bachas, L.G.: Sensitive and selective liquid chromatographic post-column reaction detection system for biotin and biocytin using and homogeneous fluorophore-linked assay. J. chromatogr., 654, 79-86 (1993).

[6] European Pharmacopoeia 5.0, 01/2005: 1073, page 110.

[7] Selavska, C.M., Jino, K.S., Krull, I.S.: Construction and comparison of open tubular reactors for post-column reaction detection in liquid chromatography. Anal. Chem., 59, 2221-2224 (1987)

[8] Evaluation of Analytical Methods used for Regulation of Foods and Drugs, W. Horwitz, Anal. Chem. 1982, 54 (1), 67A - 76A.

3 LiChrospherÒ 100 RP-18 là một ví dụ về sản phẩm có bán sẵn trên thị trường. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn, còn tiêu chuẩn này không ấn định phải sử dụng chúng. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.

...

...

...