5.2.1.2 Chuẩn bị

Hòa tan amoni clorua trong nước. Cho thêm các thành phần khác vào và đun đến sôi.

Nếu cần, chỉnh pH để sau khi khử trùng pH phải là 6,7 ± 0,2, ở 25 °C.

Chuyển các lượng đến 500 ml môi trường này sang các vật chứa thích hợp (6.10).

Khử trùng 10 min ở nhiệt độ 115 °C trong nồi hấp áp lực (6.1).

5.2.1.3 Chuẩn bị các đĩa thạch

Rót các lượng từ 12 ml đến 15 ml môi trường này vào các đĩa Petri vô trùng (6.11) và để cho đông đặc.

Làm khô các đĩa thạch [xem TCVN 6404:2008 (ISO 7218:2007)]. Các đĩa này có thể bảo quản được đến 5 ngày ở 3 °C ± 2 °C.

Các đĩa thạch cần phải đủ khô để hơi nước không xuất hiện trong 15 min khi dàn dịch cấy (1 ml).

...

...

...

5.2.2.1 Thành phần

Sản phầm thủy phân casein bằng enzym

Muối mật No.3

Axit 5-bromo-4-clo-3-indolyl-β-D-glucuronid (BCIG)

Dimetyl sulfoxit (DMSO)^b

Thạch

Nước

20,0 g

1,5 g

...

...

...

3 ml

9 g đến 18 g ^c

1000 ml

^a Ví dụ: 0,075 g muối xyclohexylamoni.

^b Dimetyl sulfoxit là rất độc khi hít hoặc tiếp xúc phải. Cần sử dụng trong tủ hút khói. Vì độc tính đó nên nhà sản xuất khuyến cáo dùng dung dịch pha loãng.

^c Phụ thuộc vào sức đông của thạch.

5.2.2.2 Chuẩn bị

Hòa tan BCIG trong dimetyl sulfoxit hoặc trong dung dịch loãng theo khuyến cáo của nhà sản xuất. Hòa tan tất cả các thành phần trên trong nước và đun đến sôi.

Chỉnh pH để sau khi khử trùng pH phải là 7,2 ± 0,2 ở 25 °C, nếu cần.

...

...

...

5.2.2.3 Chuẩn bị các đĩa thạch

Tiến hành theo 5.2.1.3.

6. Thiết bị và dụng cụ thủy tinh

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm vi sinh thông thường [xem TCVN 6404:2008 (ISO 7218:2007)] và cụ thể như sau:

6.1 Thiết bị khử trùng khô (tủ) hoặc khử trùng ướt (nồi hấp áp lực).

6.2 Tủ ấm, có thể duy trì nhiệt độ 37 °C ± 1 °C và 44 °C ± 1 °C.

6.3 Tủ sấy hoặc buồng sấy thông gió, có thể duy trì nhiệt độ từ 25 °C ± 1 °C đến 50 °C ± 1 °C, hoặc tủ thổi không khí.

6.4 Tủ lạnh (dùng để bảo quản môi trường đã chuẩn bị), có thể duy trì nhiệt độ ở 3 °C ± 2 °C.

6.5 Màng vô trùng hoặc không gây ức chế, bằng xenlulo axetat hoặc este hỗn hợp của xenlulo, có cỡ lỗ từ 0,45 µm đến 1,2 µm hoặc đường kính 82 mm.

...

...

...

6.7 Máy đo pH, có độ chính xác đến ± 0,1 đơn vị pH.

Ngưỡng đo tối thiểu là 0,01 đơn vị pH. Máy đo pH được gắn với hệ thống cân bằng nhiệt bằng tay hoặc tự động.

6.8 Pipet xả hết (đầu thổi), miệng rộng và dung tích danh định 1 ml, được chia vạch 0,1 ml.

6.9 Ống đong, có dung tích thích hợp để chuẩn bị môi trường.

6.10 Bình, ống nghiệm hoặc chai, có dung tích thích hợp để khử trùng và bảo quản môi trường cấy.

6.11 Đĩa petri, đường kính khoảng 90 mm.

6.12 Bộ dàn mẫu, bằng thủy tinh hoặc chất dẻo, ví dụ: que bằng thủy tinh, đường kính khoảng 3,5 mm, dài 20 cm được uốn vuông góc tại một đầu dài khoảng 3 cm và đầu cuối được làm nhẵn bằng cách đốt nóng.

7. Lấy mẫu

Điều quan trọng là mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải là mẫu đại diện. Mẫu không bị hư hỏng hoặc thay đổi thành phần trong quá trình vận chuyển và bảo quản.

...

...

...

8. Chuẩn bị mẫu thử

Chuẩn bị mẫu thử theo tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm. Nếu không có tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm thì các bên tự thỏa thuận về vấn đến này.

9. Cách tiến hành

9.1 Phần mẫu thử, huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng tiếp theo

Xem TCVN 6507-1 (ISO 6887-1) hoặc tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm cần xác định.

9.2 Phục hồi

9.2.1 Dùng bộ kẹp đầu tù vô trùng (6.6), đặt màng xenlulo axetat (6.5) lên bề mặt khô của hai đĩa thạch MMGA (5.2.1.3), chú ý không để lẫn bọt khí vào trong màng lọc. Dùng bộ dàn mẫu vô trùng (6.12) để dàn phẳng màng, nếu cần.

Dùng pipet vô trùng (6.8), lấy 1 ml mẫu thử hoặc huyền phù ban đầu cho vào giữa màng. Dùng bộ dàn mẫu vô trùng, dàn đều dịch cấy trên khắp bề mặt màng, tránh để tràn khỏi màng.

9.2.2 Lặp lại quy trình trong 9.2.1 với các dung dịch pha loãng thập phân tiếp theo, nếu cần, dùng pipet vô trùng khác và que dàn mẫu vô trùng khác cho mỗi dung dịch pha loãng.

...

...

...

9.3 Chuyển sang môi trường chọn lọc và ủ ấm

9.3.1 Sau khi phục hồi, dùng bộ kẹp vô trùng (6.6), chuyển sang các màng từ MMGA (môi trường phục hồi) sang các đĩa thạch đựng môi trường TBX (5.2.2.3).

CẢNH BÁO – Màng ẩm ướt sẽ dính vào bề mặt thạch. Tránh để lẫn bọt khí. Không sử dụng bộ dàn mẫu.

9.3.2 Ủ ấm các đĩa này từ 18 h đến 24 h trong tủ ấm (6.2) ở nhiệt độ 44 °C và không quá 45 °C, với màng/mặt thạch hướng lên trên. Không chồng các đĩa quá ba lớp.

9.4 Đếm các đơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU)

Sau giai đoạn ủ ấm quy định (9.3.2), đếm các CFU điển hình của Escherichia coli dương tính β-glucuronidaza trên mỗi đĩa thạch chứa ít hơn 150 CFU điển hình và ít hơn 300 CFU tổng số (điển hình và không điển hình)

Nếu dịch cấy không thể tách riêng và không thể quan sát được các khuẩn lạc điển hình, thì các đĩa chứa 0 CFU điển hình cần được xem xét theo các phương pháp tính khác nhau như trong điều 10.

10. Biểu thị kết quả

10.1 Yêu cầu chung

...

...

...

10.2 Tính toán

Để có kết quả đúng, cần đếm các CFU điển hình trên ít nhất một đĩa chứa tối thiểu 15 CFU màu xanh điển hình.

Tính N, số lượng CFU của Escherichia coli dương tính β-glucuronidaza có mặt trong mẫu thử trên mililit hoặc trên gam sản phẩm bằng công thức (1):

N =                                                              (1)

trong đó

Σa là tổng các khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa được giữ lại sau hai độ pha loãng liên tiếp, có ít nhất một đĩa chứa tối thiểu 15 CFU màu xanh;

n₁ là số đĩa được giữ lại tại độ pha loãng thứ nhất;

V thể tích dịch cấy đã dùng trên mỗi đĩa, tính bằng mililit;

n₂ là số đĩa được giữ lại tại độ pha loãng thứ hai;

...

...

...

Làm tròn các kết quả đến hai chữ số có nghĩa [xem TCVN 6404:2008 (ISO 7218:2007)].

Lấy kết quả là số lượng Escherichia coli dương tính β-glucuronidaza trên mililit (sản phẩm dạng lỏng) hoặc trên gam (sản phẩm dạng khác) được biểu thị theo số nguyên đến hai chữ số có nghĩa (dưới 100) hoặc theo số từ 1,0 đến 9,9 nhân lũy thừa của 10.

10.3 Ước tính các số lượng nhỏ

10.3.1 Nếu có hai đĩa [của mẫu thử (sản phẩm dạng lỏng) hoặc của huyền phù ban đầu (sản phẩm dạng khác) hoặc của độ pha loãng thứ nhất được cấy hoặc được giữ lại] chứa ít hơn 15 CFU điển hình, thì tính N_E số CFU của Escherichia coli dương tính β-glucuronidaza có mặt trong mẫu thử là trung bình của đĩa song song theo công thức (2):

N_E =                                                                                      (2)

Trong đó

Σc là tổng các CFU điển hình đếm được trên hai đĩa;

V thể tích dịch cấy đã dùng trên mỗi đĩa, tính bằng mililit;

n là số đĩa được giữ lại (trong trường hợp này n = 2);

...

...

...

Làm tròn các kết quả đến hai chữ số có nghĩa [xem TCVN 6404:2008 (ISO 7218:2007)].

Biểu thị kết quả như sau:

- số lượng Escherichia coli dương tính β-glucuronidaza ước tính trong một mililit (sản phẩm dạng lỏng) hoặc trong một gam (sản phẩm dạng khác): N_E = Y.

10.3.2 Nếu hai đĩa [của mẫu thử (sản phẩm dạng lỏng) hoặc huyền phù ban đầu (sản phẩm dạng khác) hoặc từ độ pha loãng thứ nhất đã cấy hoặc giữ lại] không chứa CFU điển hình nào, thì biểu thị kết quả như sau:

- ít hơn 1/d Escherichia coli dương tính β-glucuronidaza trong mililit (sản phẩm dạng lỏng) hoặc trong gam (sản phẩm dạng khác);

Trong đó d là hệ số pha loãng của huyền phù ban đầu hoặc độ pha loãng thứ nhất đã cấy hoặc giữ lại [d = 1 khi sử dụng sản phẩm dạng lỏng (mẫu thử) không cần pha loãng].

10.3.3 Nếu tất cả các CFU điển hình hoặc không điển hình trên hai đĩa ở độ pha loãng thứ nhất d₁ chứa nhiều hơn 300 CFU màu xanh có thể nhìn thấy, hoặc nếu trên hai đĩa ở độ pha loãng tiếp theo d­₂ chứa ít hơn 300 khuẩn lạc, không có CFU điển hình nào cần đếm, thì biểu thị kết quả như sau:

- ít hơn 1/d₂ và nhiều hơn 1/d₁, Escherichia coli dương tính β-glucuronidaza có trong một mililit (sản phẩm dạng lỏng) hoặc trong một gam (sản phẩm dạng khác);

Trong đó d_{1 ­}và d₂ là các hệ số pha loãng tương ứng với các dung dịch pha loãng d₁ và d₂.

...

...

...

- ít hơn 1/d₂ các CFU của Escherichia coli dương tính β-glucuronidaza có trong một mililit (sản phẩm dạng lỏng) hoặc trong một gam (sản phẩm dạng khác);

Trong đó d₂ là các hệ số pha loãng tương ứng với dung dịch pha loãng d₂.

10.4 Phương pháp tính toán: Các trường hợp đặc biệt

10.4.1 Trong trường hợp, trên hai đĩa ở đọ pha loãng d₁ chứa lớn hơn 150 CFU điển hình, trên hai đĩa ở độ pha loãng tiếp theo d₂ chứa ít hơn 15 CFU điển hình.

- nếu số lượng CFU điển hình trên từng đĩa ở độ pha loãng d₁ nằm trong khoảng từ 150 đến 167 (giới hạn trên của khoảng tin cậy đối với giá trị trung bình bằng 150 CFU), thì sử dụng phương pháp tính đối với trường hợp chung (10.2);

- nếu số lượng CFU điển hình trên từng đĩa ở độ pha loãng d₁ nhiều hơn 167 (giới hạn trên của khoảng tin cậy đối với giá trị trung bình bằng 150 CFU), thì chỉ tính đến kết quả của số đếm của độ pha loãng d₂ và thực hiện tiếp với đếm số lượng nhỏ (10.3).

10.4.2 Trong trường hợp, số đếm các CFU điển hình trên mỗi đĩa đối với tất cả các dộ pha loãng đã được cấy có nhiều hơn 150, thì biểu thị kết quả như sau:

- nhiều hơn 150/d Escherichia coli dương tính β-glucuronidaza  có trong mililit (sản phẩm dạng lỏng) hoặc gam (sản phẩm dạng khác).

Trong đó d là hệ số pha loãng của dung dịch pha loãng đã cấy sau cùng.

...

...

...

N =                                                                                       (3)

trong đó

Σc là tổng số khuẩn lạc điển hình đếm được trên hai đĩa, có ít nhất một đĩa chứa tối thiểu là 15 CFU điển hình;

V là thể tích dịch cấy đã cấy trên mỗi đĩa, tính bằng mililit;

n là số đĩa được giữ lại (trong trường hợp này n = 2);

d là hệ số pha loãng tương ứng với độ pha loãng được giữ lại.

Làm tròn kết quả đến hai chữ số có nghĩa [xem TCVN 6404:2008 (ISO 7218:2007)].

10.5 Các giới hạn tin cậy

Xem TCVN 6404:2008 (ISO 7218:2007).

...

...

...

Báo cáo thử nghiệm phải nêu rõ:

- mọi thông tin cần thiết về nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

- phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

- phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

- tất cả các điều kiện thao tác không qui định trong tiêu chuẩn này, hoặc được xem là tùy ý, cùng với mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả.

- kết quả thử nghiệm thu được, nêu rõ phương pháp biểu thị đã sử dụng; và

- nếu đáp ứng được yêu cầu về độ lặp lại thì nêu kết quả cuối cùng thu được.

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

...

...

...

[2]  DAUARE J.M. CAMPELL D.R and JOHNSON R.W Simplified direct plating method for enhanced recovery of Escherichia coli m food. Journal of Food Science 50. 1986. pp. 1736-1737. 1746.

[3] DELISE G.L and LEY A. Rapid detection of Escherichia coli in urine samples by a new chromogenic β-glucuronidase assay. J. Clin. Microbiol, 27. 1989, pp. 778-779.

[4] KILIAN M. and BULOW P. Rapid diagnosis of Enterobacieriaceae. Detection of bacterial glycosidases. Ada Pathol. Microbiol. Scand. Sect. B. 84. 1976. pp. 245-251.

[5] KILIAN M. and BULOW P. Rapid identification of Enterobacteriaceae. Use of a β-glucoronidase detecting agar medium (PGUA agar) for the identification of Escherichia coli in primary cultures of urine samples. Acta Pathol. Microbiol. Scand., Sect. B. 87, 1979. pp. 271-276.

[6] LEY A.N. BOWERS R.J. and WOLFE S. Indoxyl-β-D-glucuronide, a novel chromogenic reagenl for the specific detection and enumeration of Escherichia coli in environmental sampel. Canadian Journal of Microbiology, 34, 1988. pp. 690-693.

[7] MANAFI M. and KNEIFEL W. A combined chromogenic-fluorogenic medium for the simullaneous detection of total coliforms and E. coli in water. Zentralbl. Hyg.. 189, 1989, pp. 225-234.

[8] OGOCN L.D and WATT A.J. An evaluation of fluorogenic and chromogenic assays for the direct enumeration of Escherichia coli. Letters in Applied Microbiology. 13, 1991, pp. 212-215.

[9] RESTAINO L., FRAMPTON E.W and LYON R.H. Use of chromogenic substrate 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide (X-GLUC) for enumeration of Escherichia coli on 24 hours from ground beef. J Food Protection. 53 (6). 1990. pp. 508-510.

[10] WATKINS W.O., RIPPEY S.C., CLAVET C.R., KELLY-REITZ D.J and BURKHARDT W. Novel compound for identifying Escherichia coli. Applied Environmental Microbiology. 54. 1988, pp. 1874-1875.