8. Cách tiến hành

8.1. Chuẩn bị sắc đồ

8.1.1. Nhồi cột

Sử dụng cột được làm bằng thuỷ tinh borosilicat silan hoá vì các vật liệu làm ống khác có thể gây xúc tác làm phân huỷ thành phần mẫu. Trước khi nhồi cột, rửa và làm khô ống cột bằng dung môi, ví dụ metylen clorua, sau đó là metanol. Nhồi cột sao cho mật độ vừa phải, không nén quá vì có thể gây nên áp lực trở lại không cần thiết và cũng không lỏng quá vì sẽ tạo ra các khoảng trống trong suốt quá trình sử dụng. Không nghiền chất nhồi. Đổ đầy cột qua phễu nối với ống mềm tới đáy. Bịt đầu còn lại của cột khoảng 1,3 cm bằng bông thuỷ tinh và vừa đổ vừa lắc, bung nhẹ nhưng không được sử dụng thiết bị rung sử dụng điện do nó có thể làm đứt đoạn chất nhồi. Có thể áp dụng máy hút chân không để bịt phần cuối. Bịt đầu còn lại bằng bông thuỷ tinh silan hoá.

8.1.2. Ổn định

Nhiệt thích hợp và ổn định thuốc trừ sâu là rất cần thiết để không phải xả cột và có thể thực hiện phân tích sắc ký khí. Quy trình sau mang lại những kết quả rất tốt, nối cột đã nhồi với cổng bơm. Không nối cột với detector, tuy nhiên, duy trì tốc độ khi qua detector bằng việc sử dụng dòng khí mang, hoặc trong các lò cột kép bằng cách nối một cột chưa nhồi với detector. Điều chỉnh tốc độ khí mang khoảng 50 ml/min và tăng dần nhiệt độ lò đến 230 ^oC (thời gian 1 h). Sau 24 h đến 48 h tại nhiệt độ này, cột sẵn sàng để ổn định thuốc trừ sâu.

Điều chỉnh nhiệt độ lò và tốc độ khí mang tới gần mức hoạt động. Bơm sáu lần liên tiếp hỗn hợp thuốc trừ sâu đậm đặc qua cột và cách nhau khoảng 15 min. Chuẩn bị hỗn hợp bơm này từ lindan (γ-BHC), heptaclo, aldrin, heptaclo epoxit, deildrin, endrin và p,p'-DDT, mỗi hợp chất có nồng độ 200 ng/µl. Sau khi ổn định thuốc trừ sâu, nối cột với detector và để cân bằng ít nhất trong 1 h, tốt nhất là để qua đêm. Khi đó cột sẵn sàng để sử dụng.

8.1.3. Kỹ thuật bơm

8.1.3.1. Xây dựng kỹ thuật bơm có nhịp đều và thời gian không đổi. Kỹ thuật "bơm dung môi" được miêu tả dưới đây đã được sử dụng thành công và được khuyến nghị để ngăn chặn mẫu thổi ngược hoặc chưng cất trong xylanh. Rửa xylanh bằng dung môi, sau đó cho một lượng nhỏ dung môi sạch vào xylanh (ví dụ 1 µl trong xylanh dung tích 10 µl). Tháo kim khỏi dung môi và rút khoảng 1 µl không khí. Đối với cột đã nhồi, rút ra từ 3 µl đến 4 µl mẫu chiết. Ghi lại thể tích mẫu chiết giữa các túi khí. Nhanh chóng lắp kim qua đường dẫn, ấn pittông xuống, rút xylanh ra. Sau mỗi lần bơm, làm sạch hoàn toàn xylanh bằng cách tráng vài lần bằng dung môi.

...

...

...

8.2. Cách xử lý mẫu

8.2.1. Lấy mẫu - Đổ mẫu vào bình, đầy tới cổ bình. Lấy hai mẫu giống nhau

8.2.2. Chiết mẫu - Lắc kỹ mẫu và đo chính xác tất cả mẫu trong ống đong có vạch chia dung tích 1 I, nếu cần đo hai lần (hoặc sử dụng bình mẫu đã được hiệu chuẩn trước để tránh thao tác chuyển mẫu). Rót mẫu vào phễu chiết dung tích 2 I. Rửa bình mẫu và ống đong bằng 60 ml dietyl ete 15 % hoặc metylen clorua trong hexan, rót dung môi này vào trong phễu chiết và lắc mạnh trong 2 min. Để các pha tách trong ít nhất 10 min.

Xả pha nước từ phễu chiết vào bình mẫu và rót cẩn thận pha hữu cơ vào cột OD dài 2 cm có chứa từ 8 cm đến 10 cm Na₂SO₄ vào trong thiết bị cô cất (Kuderna-Danish) phù hợp với ống ly tâm có dung tích 10 ml. Rót mẫu trở lại vào phễu chiết.

Rửa bình mẫu bằng 60 ml dung môi hỗn hợp, sử dụng dung môi để chiết lặp lại mẫu, và cho pha hữu cơ qua Na₂SO_4. Hoàn thành lần chiết thứ ba với 60 ml dung môi hỗn hợp mà được sử dụng để rửa bình mẫu, và cho pha hữu cơ qua Na₂SO₄. Rửa Na₂SO₄ bằng hexan và để khô. Lắp thiết bị cô cất với cột sinh hàn 3 bóng và giảm dung tích xuống còn khoảng 7 ml trên bếp cách thủy (90 ^oC đến 95 ^oC). Tại điểm này, tất cả metylen clorua có mặt trong dung môi chiết ban đầu đã bị chưng cất. Để nguội, lấy ống ly tâm ra khỏi thiết bị cô cất, rửa thuỷ tinh nhám và pha loãng đến 10 ml bằng hexan. Thực hiện phép phân tích sắc ký khí bắt đầu ở dung dịch pha loãng này.

8.2.3. Sắc ký khí - bơm 3 µl đến 4 µl dung dịch chiết vào cột đã nhồi. Luôn luôn bơm cùng một thể tích. Kiểm tra sắc đồ thu được đối với các pic tương ứng với lượng thuốc trừ sâu và kiểm tra sự có mặt của các chất gây nhiễu.

8.2.3.1. Nếu có các pic thuốc trừ sâu hợp lý và không bị nhiễu nhiều, chạy sắc ký lại phần chiết trên cột khác.

8.2.3.2. Bơm các dung dịch tiêu chuẩn thường xuyên để đảm bảo các điều kiện thao tác tốt nhất. Nếu cần, cô đặc hoặc pha loãng (không sử dụng metylen clorua) phần chiết để kích cỡ pic của thuốc trừ sâu gần với các pic của dung dịch tiêu chuẩn. (Xem hệ số pha loãng 9.1).

8.2.3.3. Nếu xuất hiện nhiều nhiễu, tách các chất nhiễu khỏi mẫu thuốc trừ sâu bằng cách sử dụng quy trình làm sạch như được mô tả ở phần tiếp theo.

...

...

...

Thực hiện phép rửa giải đầu tiên bằng 200 ml etyl ete 6 % trong ete dầu mỏ, và thứ hai bằng 200 ml etyl ete 15 % trong ete dầu mỏ. Thực hiện phép rửa giải thứ ba bằng 200 ml etyl ete 50 % trong ete dầu mỏ và lần thứ tư bằng 200 ml etyl ete 100 %. Tiếp theo bằng 50 ml đến 100 ml ete dầu mỏ để đảm bảo loại bỏ tất cả etyl ete ra khỏi cột. Cách khác, để tách phần rửa PCB đầu tiên bằng etyl ete 0 % trong ete dầu mỏ và tiến hành như trên để mang lại bốn phân đoạn.

Cô đặc các phần rửa giải trong thiết bị cô cất trên bếp cách thủy như trong 8.2.2, pha loãng đến thể tích thích hợp và phân tích bằng sắc ký khí.

Thành phần rửa giải - bằng cách sử dụng lượng tương đương của bất kỳ mẻ oxit magie silica gel như đã được xác định bởi chỉ số axit lauric của chúng (xem phụ lục A) thuốc trừ sâu sẽ bị phân tách thành các phần rửa giải như dưới đây:

Phần rửa giải etyl ete 6 %:

Aldrin

BHC

Clodan

DDD

DDE

...

...

...

Heptaclo

Heptaclo epoxit

Lindan (γ-BHC)

Methoxyclo

Mirex

Pentacloro-nitrobenzen

Stroban

Toxaphen

Trifluralin

...

...

...

Phần rửa giải etyl ete 15%:

Endosufan I

Endrin

Dieldrin

Diclora

Phtalat este

Phần rửa giải etyl ete 50%:

Endosulfan II

...

...

...

Nếu có mặt, thuốc trừ sâu thiophosphat sẽ xuất hiện trong từng phân đoạn trên giống như trong phân đoạn ete 100 %. Đối với thông tin bổ sung liên quan đến thành phần rửa giải và quy trình xác định chỉ số axit lauric, tham khảo tài liệu phân tích thuốc trừ sâu FDA (xem thư mục tài liệu tham khảo). Đối với quy trình thử mô hình rửa giải, xem Phụ lục A.4.

8.2.5. Xác định hiệu suất chiết

Thêm những lượng đã biết (với các nồng độ giống nhau để có được nồng độ mong muốn trong các mẫu) của thuốc trừ sâu trong dung dịch etyl axetat vào 1 I nước và thực hiện quy trình tương tự như đối với các mẫu phân tích. Pha loãng một lượng ngang bằng dung dịch thuốc trừ sâu có nồng độ trung gian (5.13) với thể tích cuối cùng như nhau. Gọi chiều cao pic của dung dịch tiêu chuẩn là "a" và chiều cao pic của mẫu mà thuốc trừ sâu được thêm vào là "b" và hiệu suất chiết là b/a. Xác định định kỳ hiệu suất chiết và kiểm soát mẫu trắng để thử nghiệm quy trình.

Đồng thời tiến hành phân tích mẫu kép với mỗi loạt mẫu để kiểm soát chất lượng.

9. Biểu thị kết quả

9.1. Hệ số pha loãng

Nếu phần dung dịch chiết được cô đặc, hệ số pha loãng, D, là phân số thập phân; nếu phần dung dịch chiết được pha loãng, hệ sô pha loãng vượt quá 1.

9.2. Xác định nồng độ thuốc trừ sâu

Bằng phép so sánh trực tiếp với dung dịch tiêu chuẩn đơn khi thể tích bơm và giá trị pic tương ứng nằm trong 10 % của mẫu thuốc trừ sâu cần xác định (Bảng 1). Nồng độ thuốc trừ sâu (c), tính bằng µg/l theo công thức.

...

...

...

A x B x C x D

E x F x G

Trong đó.

A là lượng dung dịch thuốc trừ sâu tiêu chuẩn, tính bằng ng;

B là chiều cao pic của mẫu, tính bằng mm hoặc số đếm diện tích;

C là thể tích phần chiết, tính bằng µI;

D hệ số pha loãng;

E chiều cao pic của dung dịch tiêu chuẩn, tính bằng mm hoặc số đếm diện tích;

F thể tích phần chiết được bơm, tính bằng µl;

...

...

...

Các sắc đồ điển hình của hỗn hợp thuốc trừ sâu đại diện được trình bày từ Hình 1 đến Hình 5.

Báo cáo các kết quả theo microgram trên lit và không hiệu chỉnh hiệu suất.

10. Độ chụm và độ chệch

Mười phòng thử nghiệm trong một nghiên cứu liên phòng thử nghiệm đã lựa chọn mẫu nước riêng của mình và cho thêm bốn thuốc trừ sâu đại diện để tái tạo mẫu, tại hai nồng độ trong axeton. Thuốc trừ sâu được cho thêm lấy từ nguồn đơn lẻ. Mẫu được phân tích có và không có chất làm sạch oxit magie silica gel. Độ chụm và dữ liệu thu hồi được đưa ra trong Bảng 2.

Bảng 1 - Tỷ lệ lưu giữ của các thuốc trừ sâu clo hữu cơ khác nhau liên quan đến aldrin

Pha lỏng ^a

1,5 % OV-17

+

1,95 % QF-1

...

...

...

5 %

OV-210

3 %

OV-1

6 % QF-1

+

4 % SE-30

Nhiệt độ cột

...

...

...

180 °C

180 ^oC

200 ^oC

Tốc độ khí mang argon/metan

60 ml/min

70 ml/min

70 ml/min

60 ml/min

Thuốc trừ sâu

...

...

...

RR

RR

RR

α-BHC

0,54

0,64

0,35

0,49

PCNB

...

...

...

0,85

0,49

0,63

Lindan (γ-BHC)

0,69

0,81

0,44

0,60

Dicloran

...

...

...

1,29

0,49

0,70

Heptaclo

0,82

0,87

0,78

0,83

Aldrin

...

...

...

1,00

1,00

1,00

Heptaclo epoxit

1,54

1,93

1,28

1,43

Endosulfan I

...

...

...

2,48

1,62

1,79

p.p'-DDE

2,23

2,10

2,00

1,82

Dieldrin

...

...

...

3,00

1,93

2,12

Captan

2,59

4,09

1,22

1,94

Endrin

...

...

...

3,56

2.18

2,42

o.p'-DDT

3,16

2,70

2,69

2,39

p.p'-DDD

...

...

...

3,75

2,61

2,55

Endosulfan II

3,59

4,59

2,25

2,72

p.p’-DDT

...

...

...

4,07

3,50

3,12

Mirex

6,1

3,78

6,6

4,79

Methoxyclo

...

...

...

6,5

5,7

4,60

Aldrin

(Min tuyệt đối)

3,5

2,6

...

...

...

4,0

5,6

^a Tất cả cột thủy tinh, có chiều dài 180 cm, đường kính trong 4 mm, chất rắn bổ trợ sắc ký khí Q (100/200 mesh).

Bảng 2 - Dữ liệu độ chụm và độ chệch đối với các thuốc trừ sâu clo hữu cơ được chọn

Thuốc trừ sâu

Mức thêm

ng/L

...

...

...

Thu hồi

trung bình

ng/L

Hiệu suất

thu hồi

%

Độ chụm ^a

ng/L

S_t

...

...

...

Aldrin

10

Không rửa

10,42

69

4,86

2,59

110

...

...

...

79,00

75

32,06

20,19

25

Rửa ^b

17,00

68

...

...

...

3,48 ^c

100

64,54

68

27,16

8,02 ^c

Lindan

...

...

...

Không rửa

9,67

97

5,28

3,47

(γ-BHC)

110

72,91

...

...

...

26,23

11,49 ^c

15

Rửa ^b

14,04

94

8,73

5,20

...

...

...

85

59,08

70

27,49

7,75 ^c

Dieldrin

20

Không rửa

...

...

...

108

18,16

17,92

125

105,83

85

30,41

...

...

...

25

Rửa ^b

17,52

70

10,44

5,10 ^c

130

...

...

...

84,29

65

34,45

16,79 ^c

DDT

40

Không rửa

40,30

101

...

...

...

13,42

200

154,87

77

38,80

24,02

...

...

...

Rửa ^b

35,54

118

22,62

22,50

185

132,08

...

...

...

49,83

25,31

^a S_t = độ chụm toàn bộ và S_o = độ chụm đơn lẻ

^b Sử dụng việc rửa cột oxit magie silica gel trước khi phân tích

^c S₀ < S_t/2

Phụ lục A

(tham khảo)

Tiêu chuẩn hoá cột oxit magie silica gel bằng các điều chỉnh khối lượng trên cơ sở hấp phụ axit lauric

...

...

...

A.1. Thuốc thử

A.1.1. Rượu etylic, USP hoặc tuyệt đối, được trung hóa bằng phenolphthalein.

A.1.2. Hexan, được chưng cất từ tất cả các thiết bị dụng cụ thuỷ tinh.

A.1.3. Dung dịch axit lauric: chuyển 10,000 g axit lauric vào bình định mức dung tích 500 ml, hoà tan bằng hexan và pha loãng đến thể tích 500 ml; 1 ml = 20 mg.

A.1.4. Chất chỉ thị phenolphthalein: hoà tan 1 g phenolphtalein trong alcol và pha loãng đến thể tích 100 ml.

A.1.5. Natri hydroxit, 0,05 N: pha loãng 25 ml NaOH 1 N đến 500 ml bằng nước cất. Tiêu chuẩn hóa như sau: cân 100 mg đến 200 mg axit lauric vào bình nón dung tích 125 ml; thêm 50 ml rượu etylic và 3 giọt chất chỉ thị phenolphthalein, chuẩn độ đến điểm cuối; và tính số miligam axit lauric trên mililit NaOH (khoảng 10 mg/ml).

A.2. Cách tiến hành

Chuyển 2,000 g oxit magie silica gel vào bình nón có nút thuỷ tinh nhám dung tích 25 ml. Bọc bằng giấy nhôm và gia nhiệt qua đêm ở 130 ^oC. Đậy nút lại, để nguội đến nhiệt độ phòng, thêm 20,0 ml dung dịch axit lauric (400 mg), đậy nút và thỉnh thoảng lắc trong 15 min. Để phần hấp phụ lắng xuống và hút 10,0 ml phần nổi lên trên vào bình nón dung tích 125 ml. Tránh hút phần gel. Thêm 50 ml rượu etylic và 3 giọt phenolphthalein; chuẩn độ bằng NaOH 0,05 N đến điểm cuối.

A.3. Biểu thị kết quả và điều chỉnh khối lượng cột

...

...

...

Trị số axit lauric = mg axit lauric/g gel

                        = 200 - (ml cần để chuẩn độ x mg axit lauric/ ml NaOH 0,05 N)

Để nhận được một lượng bằng nhau của mẻ gel bất kỳ, chia 110 cho trị số axit lauric đối với mẻ đó và nhân với 20 g. Kiểm tra phần rửa giải thích hợp của thuốc trừ sâu bằng qui trình đã cho dưới đây.

A.4. Phép thử mô hình rửa giải thích hợp và thu hồi thuốc trừ sâu

Chuẩn bị phép thử hỗn hợp có chứa aldrin, heptaclo epoxit, p,p'-DDE, dieldrin, parathion và malathion. Dieldrin và parathion được tách rửa đến 15 % phần rửa giải; tuy nhiên tất cả vết malathion đến 50 % phần rửa giải và các chất khác là 6 %.

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Food and drug administration, 1968 (revised 1978). Pesticide Analytical Manual, 2^nd ed. U.S. Dep, Health, Education & Welfare, Washington, D.C. [Quản lý thực phẩm và dược phẩm, 1968 (soát xét 1978), Sổ tay phân tích thuốc trừ sâu, xuất bản lần thứ hai, Ủy ban sức khoẻ, Giáo dục và Phúc lợi Hoa Kỳ, Washington, D.C.]