6.1.2. Cột - Cột dạng ống hở chứa 5% phenylpolydimetylsiloxan liên kết và lớp mỏng phủ bên trong có pha liên kết nang. Cột phải có nhiệt độ giới hạn trên ít nhất là 400⁰C. Cột có chiều dài bằng 10m hoặc 15m, đường kính trong bằng 0,32mm, và độ dày màng bằng 0,1mm là phù hợp. Có thể sử dụng bất kỳ loại cột nào, miễn là có hiệu quả và độ nhạy tương đương hoặc tốt hơn. Nên dùng loại cột bảo vệ chịu nhiệt độ cao, dài 2m đến 5m, đường kính 0,53mm nối từ đầu phun đến cột phân tích. Có thể dùng các đầu phun tự động, đồng thời làm tăng tuổi thọ cột.

6.2. Hệ thống thu nhập dữ liệu điện tử

6.2.1. Máy tích phân hoặc máy vi tính, khuyến cáo dùng các loại máy có khả năng vẽ đồ thị theo thời gian thực và hiện số các dữ liệu sắc ký khí. Có thể đo điện tích pic và thời gian lưu bằng máy vi tính hoặc máy tích phân điện tử.

6.2.2. Thiết bị này có khả năng thực hiện hiệu chuẩn dạng chuẩn nội đa cấp và có thể tính hệ số tương quan (r²) và tính toán chất chuẩn nội cho từng bộ dữ liệu hiệu chuẩn.

7. Thuốc thử và vật liệu

7.1. Độ tinh khiết của các thuốc thử - Trong toàn bộ các phép thử đều sử dụng các hóa chất cấp thuốc thử. Nếu không có qui định khác thì tất cả các thuốc thử phải phù hợp với các tiêu chuẩn hiện hành. Có thể sử dụng các loại khác, với điều kiện đảm bảo rằng các thuốc thử này có độ tinh khiết cao phù hợp, khi sử dụng không làm giảm độ chính xác của phép thử.

7.2. n-heptan, cấp thuốc thử.

7.3. N-metyl-N-trimetylsilytrifluoceramide (MSTFA), cấp thuốc thử

7.4. Pyrindine, cấp thuốc thử.

...

...

...

7.6. Microxylanh - dung tích 100ml và 200ml.

7.7. Bình có nắp vặn, dung tích 10ml, có nắp ngăn bằng polytetrafluoroetylen (PTFE).

8. Chuẩn bị thiết bị

Lắp và luyện cột theo hướng dẫn của nhà chế tạo hoặc cung cấp thiết bị. Sau khi luyện xong, gắn đầu ra của cột với đầu vào detector ion hóa ngọn lửa và kiểm tra sự rò rỉ trên toàn bộ thiết bị. Nếu phát hiện có rò rỉ thì phải siết chặt lại hoặc thay các phụ tùng, sau đó kiểm tra lại trước khi thực hiện tiếp.

9. Hiệu chuẩn và chuẩn hóa

9.1. Chuẩn bị các chất lập đường chuẩn - Chuẩn bị các chất chuẩn bằng cách sử dụng các hợp chất mới pha như trong Bảng 2, theo ASTM D 4307. Cân trực tiếp các thành phần trong các bình định mức qui định và ghi lại khối lượng chính xác đến 0,1mg. Dùng pyridine pha loãng đến vạch mức. Bảo quản trong tủ lạnh khi chưa dùng.

Bảng 2 - Dung dịch gốc

Thành phần

Số CAS

...

...

...

Bình định mức, ml

Glycerin

56-81-5

25

50

1-Mono [cis-9-octadecenoyl]-racglycerol (monoolein)

111-03-5

50

10

...

...

...

2465-32-9

50

10

1,2,3-Tri [cis-octadecenoyl]glycerol (triolein)

122-32-7

50

10

(S)-(-)-1,2,4-Butanetriol-

(Chuẩn nội 1)

...

...

...

25

25

1,2,3-Tridecanolylgycerol (tricaprin) -

(Chuẩn nội 2)

621-71-6

80

10

9.2. Dung dịch chuẩn - Chuẩn bị năm dung dịch chuẩn như trong bảng 3, dùng microxylanh chuyển một thể tích qui định vào các bình 10ml có nắp ngăn. Lần lượt cho 100ml MSTFA vào năm dung dịch chuẩn. Đóng nắp bình và lắc. Để bình tại nhiệt độ phòng từ 15min đến 20min. Cho khoảng 8ml n-heptan vào bình và lắc đều.

9.3. Phân tích sắc ký - Nếu dùng dụng cụ lấy mẫu tự động thì chuyển từng lượng dung dịch vào bình GC thủy tinh và đậy bằng nắp phủ lớp TFE-fluorocacbon.

...

...

...

rsp_i = (A_i/A_s)                  (1)

trong đó

A_i là diện tích của chất chuẩn, và

A_s là diện tích chất chuẩn nội.

amt_i = (W_i/W_s)               (2)

trong đó

W_i  là khối lượng chất chuẩn, và

W_s là khối lượng của chất chuẩn nội.

9.4.1. Xây dựng đường chuẩn cho từng thành phần của mỗi chất chuẩn bằng cách đánh dấu theo trục y các tỷ lệ tín hiệu (rsp_i), các tỷ lệ về lượng (amt_i) theo trục x.

...

...

...

                       (3)

trong đó

x = X_i -                                   (4)

y = Y_i -                                  (5)

và:

X_i điểm thể hiện tỷ lệ amt_i ;

 các giá trị trung bình đối với tất cả các điểm (amt_i);

Y_i điểm thể hiện tỷ lệ tương ứng rsp_i, và

 các giá trị trung bình của tất cả các điểm (rsp_i).

...

...

...

W_x/W_is = a_x x (A_x/A_is) + b_x                                    (6)

trong đó

W_x khối lượng chất chuẩn, tính bằng miligam;

W_is khối lượng chất chuẩn nội, tính bằng miligam;

A_x diện tích pic của chất chuẩn;

A_is diện tích pic của chất chuẩn nội;

a_x độ dốc của hàm hiệu chuẩn;

b_x phần cắt của hàm hiệu chuẩn.

Bảng 3 - Dung dịch chuẩn

...

...

...

1

2

3

4

5

ml của dung dịch gốc glycerin

10

30

50

...

...

...

100

ml của dung dịch gốc monoolein

20

50

100

150

200

ml của dung dịch gốc diolein

10

...

...

...

40

70

100

ml của dung dịch gốc triolein

10

20

40

70

100

...

...

...

100

100

100

100

100

ml của dung dịch gốc tricaprin

100

100

100

...

...

...

100

10. Cách tiến hành

10.1. Vận hành thiết bị theo các giá trị nêu tại Bảng 1. Cân trực tiếp khoảng 100mg mẫu chính xác đến 0,1mg vào bình 10ml có nắp ngăn. Dùng micro xylanh cho chính xác 100ml của từng chất chuẩn nội và MSTFA. Lắc bình và để bình tại nhiệt độ phòng từ 15min đến 20min. Cho khoảng 8ml n-heptan vào bình và lắc đều.

10.2. Bơm 1ml hỗn hợp phản ứng vào cổng bơm cột làm lạnh và bắt đầu phân tích. Thu được sắc ký đồ và báo cáo tích phân của pic.

10.3. Nhận dạng pic - Nhận dạng các pic bằng cách so sánh thời gian lưu với các chất chuẩn. Để nhận dạng các pic bổ sung, sử dụng thời gian lưu tương đối trong Bảng 4 và sắc ký đồ so sánh trên Hình 1. Các mono-, di-, và triglyceride được tách theo số cacbon (CN).

Bảng 4 - Thời gian lưu tương đối

Thành phần

Dùng chất chuẩn nội

Thời gian lưu tương đối

...

...

...

1,2,4 Butanetriol

Chất chuẩn nội 1

Monopaimitin

Monoolein, Monolinolein

Monolinolenin, và monostearin

Tricaprin

Chất chuẩn nội 2

Diglyceride

Triglyceride

...

...

...

2

2

2

2

...

...

...

1,00

0,76

0,83-0,86

1,00

1,05 đến 1,09

1,16 đến 1,31

...

...

...

Hình 1 - Sắc ký đồ để so sánh

10.4. Monoglyceride gồm bốn pic chồng lấn nhau với thời gian lưu tương đối (RRT) bằng 0,76 và 0,83 đến 0,86 đối với chất chuẩn nội tricaprin. Este metyl có số cacbon bằng 24 có thể xuất hiện một cặp pic với RRT bằng 0,80 đến 0,82 và không nằm trong kết quả tính toán cho monoglyceride.

10.5. Diglyceride cũng có thể tách theo số cacbon, nhưng do các liên kết đôi khác nhau trong các phân tử, nên sự phân giải đường nền của các pic không xuất hiện. Một nhóm từ 3 đến 4 pic với RRT bằng 1,05 đến 1,09 (CN 34, 36 và 38) được qui cho diglyceride. Số cacbon cũng tách các diglyceride. Các pic có RRT bằng 1,16 đến 1,31 (CN 52, 54, 56 và 58) sẽ bao gồm trong tính toán.

11. Tính toán và báo cáo kết quả

11.1. Sau khi nhận dạng các pic, đo điện tích pic của mono-, di-, và triglyceride. Sử dụng độ dốc và phần chắn -y của hàm số hiệu chuẩn, tính khối lượng từng chất như sau:

11.1.1. Glycerin

G = (a_g x A_g /A_is1 + b_g ) x W_is1 x 100/W                  (7)

trong đó

G phần trăm khối lượng của glycerin trong mẫu;

...

...

...

A_is1 diện tích pic của chất chuẩn nội 1;

W_is1 khối lượng của chất chuẩn nội 1, tính bằng miligam;

W khối lượng mẫu, tính bằng miligam;

a_g độ dốc của hàm hiệu chuẩn;

b_g phần chắn của hàm hiệu chuẩn.

11.1.2. Các glycerise riêng lẻ

Gl_i = (a_ol x A_gli /A_is2 + b_ol) x W_is2 x 100 / W                          (8)

trong đó

Gl_i phần trăm khối lượng của từng glyceride trong mẫu;

...

...

...

A_is2 diện tích pic của chất chuẩn nội 2;

W_is2 khối lượng của chất chuẩn nội 2, tính bằng miligam;

W khối lượng mẫu, tính bằng miligam;

a_ol độ dốc của hàm hiệu chuẩn đối với mono-, di-, và triolein;

b_ol phần chắn của hàm hiệu chuẩn đối với mono-, di-, và triolein.

11.1.3. Tính glycerin tổng

Glycerin tổng = glycerin tự do + glycerin liên kết                          (9)

trong đó

glycerin tự do = glycerin xác định theo công thức 7.

...

...

...

trong đó

Gl_M = 0,2591 x S monoglyceride, % khối lượng, xác định theo công thức 8;

Gl_D = 0,1488 x S diglycerde, % khối lượng, xác định theo công thức 8;

Gl_T = 0,1044 x S triglyceride, % khối lượng, xác định theo công thức 8;

11.2. Báo cáo kết quả của glycerin tự do và glycerin tổng chính xác đến 0,001% khối lượng.

12. Độ chụm và độ chệch

12.1. Độ chụm - Độ chụm được xác định theo phương pháp kiểm tra thống kê các kết quả thử nghiệm liên phòng năm 2006, như sau:

12.1.1. Độ lặp lại - Chênh lệch giữa hai kết quả thử liên tiếp nhận được do cùng một thí nghiệm viên tiến hành trên cùng một thiết bị, dưới các điều kiện thử không đổi, trên cùng một mẫu thử, trong một thời gian dài với thao tác bình thường và chính xác của phương pháp thử này, chỉ một trong 20 trường hợp được vượt các giá trị sau:

12.1.1.1. Độ lặp lại của glycerin tổng:

...

...

...

trong đó

X là kết quả tính được theo % khối lượng;

r là độ lặp lại.

12.1.1.2. Độ lặp lại của glycerin tự do:

r = 2,339 E^-02 x (X + 1,000 E^-04)^0,4888                                  (11)

trong đó

X là kết quả tính được theo % khối lượng;

r là độ lặp lại.

12.1.2. Độ tái lập - Chênh lệch giữa hai kết quả thử độc lập, nhận được do hai thí nghiệm viên khác nhau làm việc trong hai phòng thử nghiệm khác nhau, trên cùng một mẫu thử, trong một thời gian dài với thao tác bình thường và chính xác của phương pháp thử này, chỉ một trong 20 trường hợp được vượt các giá trị sau:

...

...

...

r = 0,4928 x (X +2,510 E^-02)                                            (12)

trong đó

X là kết quả tính được theo % khối lượng;

R là độ tái lập.

CHÚ THÍCH 1: Độ chụm của toàn bộ các số liệu (với sự chuyển đổi không thông dụng) báo trước cho thấy rằng độ chụm này chỉ áp dụng cho các giá trị trên 0,13. Các mẫu khác là dưới giới hạn định lượng. Đối với các giá trị dưới giới hạn định lượng, không đánh giá được độ chụm.

12.1.2.2. Độ tái lập của glycerin tự do:

R = 0,1082 x (X + 1,000 E^-04)^0,4888                         (13)

trong đó

X là kết quả tính được theo % khối lượng;

...

...

...

12.2. Độ chệch - Do không có chất chuẩn phù hợp được chấp nhận để xác định độ chệch cho phương pháp này, vì vậy không qui định về độ chệch.