Nhân tỷ số trung bình thu được đối với các mẫu hiệu chuẩn A và B với hiệu chỉnh máy đo độ sáng sử dụng công thức (9):

C_r1 = C_r x R_m                                          (9)

trong đó

C_r1 là hiệu chỉnh máy đo độ sáng mới ;

C_r là hiệu chỉnh máy đo độ sáng tính được (xem 8.1.7);

R_m là tỷ số trung bình của các mẫu hiệu chuẩn A và B (xem Bảng 1);

Thay đổi hiệu chỉnh máy đo độ sáng mới thu được về giá trị mới của nó, C_r1.

8.2.1.3 Trong các trường hợp, khi giá trị trung bình nhỏ hơn đáng kể (nhỏ hơn 10 đơn vị) so với giá trị đích và giá trị trung bình của mẫu hiệu chuẩn khác lớn hơn đáng kể (lớn hơn 10 đơn vị) so với giá trị đích, thì xác định chênh lệch giữa giá trị trung bình của mẫu hiệu chuẩn A (A₁ = 44 mU/I hoặc A₂ = 88 mU/I).

Bổ sung giá trị này vào giá trị nền của máy đo độ sáng; nếu giá trị này nhỏ hơn giá trị đích thì chênh lệch là số âm và kết quả dẫn đến giảm giá trị nền.

...

...

...

B_g2 = B_g + (A_1m - 44)                                (10)

trong đó

B_g là giá trị nền của máy đo độ sáng tính được (xem 8.1.8);

B_g2 là giá trị nền mới của máy đo độ sang;

A_1m là giá trị trung bình của mẫu hiệu chuẩn A₁ (xem 8.1.11);

44 là giá trị đích của mẫu hiệu chuẩn A₁.

b) Tính giá trị nền mới Bg₃ đối với mẫu hiệu chuẩn A₂ sử dụng công thức (11):

B_g3 = B_g + (A_2m - 88)                                (11)

trong đó

...

...

...

B_g3 là giá trị nền mới của máy đo độ sáng;

A_2m là giá trị trung bình của mẫu hiệu chuẩn A₂ (xem 8.1.11);

88 là giá trị đích của mẫu hiệu chuẩn A₂.

c) Chỉnh cài đặt nền máy đo độ sáng như tính toán được. Phân tích lại mẫu hiệu chuẩn B và xác định giá trị trung bình [B_{m (1 hoặc 2)}]. Chia giá trị trung bình thu được cho giá trị đích (B₁ và B₂ = 175 mU/I).

Nhân tỷ số này với hiệu chỉnh máy đo độ sáng theo công thức (12):

C_r2 = C_r x                                  (12)

trong đó

C_r là hiệu chỉnh máy đo độ sáng tính được (xem 8.1.7);

C_r2 là hiệu chỉnh máy đo độ sáng mới;

...

...

...

175 là giá trị đích của mẫu hiệu chuẩn B₁ hoặc B₂.

Điều chỉnh máy đo độ sáng về giá trị mới.

8.2.2 Lặp lại các bước 8.1.11 đến 8.1.13. Các số đọc trung bình của máy đo độ sáng phải từ 32 mU/I đến 55 mU/I đối với các mẫu hiệu chuẩn làm việc A1, và phải trong dải từ 45 mU/I đến 110 mU/I đối với mẫu hiệu chuẩn A₂. Lặp lại phép xác định này nếu có một giá trị bất kỳ nào lớn hơn hoặc nhỏ hơn 40% giá trị trung bình.

Giá trị trung bình đối với mẫu hiệu chuẩn làm việc B (B₁ hoặc B₂) phải trong dải từ 145 mU/I đến 205 mU/I. Lặp lại phép xác định này nếu có một giá trị bất kỳ nào sai lệch quá 30% giá trị trung bình.

Nếu cả hai giá trị nằm trong dải này thì tiến hành tiếp theo 8.3.3. Nếu giá trị trung bình của mẫu hiệu chuẩn vẫn nằm ngoài dải quy định tiến hành tiếp theo 8.1.1.

8.3 Phép kiểm chứng và kiểm tra hiệu chuẩn

8.3.1 Phép kiểm chứng âm tính

Tiến hành kiểm chứng âm tính theo quy trình xác định (8.4) mà không bổ sung phần mẫu thử (8.4.2). Phép thử kiểm chứng âm tính là để kiểm tra việc hiệu chuẩn máy đo độ sáng và thuốc thử. Kiểm tra hệ thống (kết quả âm tính) khi các mức hoạt độ phosphataza kiềm thu được nhỏ hơn 5 mU/I trong kênh của máy đo độ sáng đã hiệu chuẩn thích hợp.

8.3.2 Phép kiểm chứng dương tính

...

...

...

Tiến hành phép kiểm chứng dương tính hàng ngày, để kiểm tra hiệu chuẩn của máy đo độ sáng và thuốc thử. Nếu giá trị này vượt quá 585 mU/I hoặc nhỏ hơn 300 mU/I thì lặp lại với mẫu kiểm chứng dương tính đã hoàn nguyên khác. Nếu giá trị thu được lần này vẫn nằm ngoài dải quy định thì hiệu chuẩn lại máy đo độ sáng (xem 8.1).

8.3.3 Kiểm tra hiệu chuẩn

8.3.3.1 Sau khi đã thực hiện các bước hiệu chuẩn trong 8.1 và 8.2, tiến hành phép thử kiểm chứng âm tính (8.3.1) và tiến hành ba phép thử lặp lại với mẫu kiểm chứng dương tính (8.3.2) để kiểm tra xác nhận kết quả hiệu chuẩn.

8.3.3.2 Phép kiểm chứng âm tính phải cho giá trị nhỏ hơn 5 mU/I và phép thử kiểm chứng dương tính (N = 3) phải cho giá trị trung bình trong dải từ 380 mU/I đến 510 mU/I. Nếu kết quả kiểm chứng âm tính nằm ngoài dải này thì sử dụng cơ chất mới (4.1) và lặp lại phép thử. Nếu kết quả kiểm chứng dương tính nằm ngoài dải này hoặc có một giá trị bất kỳ nào vượt quá 585 mU/I hoặc nhỏ hơn 300 mU/I, thì kiểm tra nhiệt độ của dung dịch hãm (4.2) và lặp lại phép thử với mẫu kiễm chứng dương tính đã hoàn nguyên khác. Nếu giá trị thu được lần này vẫn nằm ngoài dải của các phép thử thì hiệu chuẩn lại (xem 8.1.1).

CHÚ THÍCH   Phép xác định lặp lại ba lần của mẫu kiểm chứng chương trình đã dùng để kiểm tra hiệu chuẩn. Sau khi kiểm tra hiệu chuẩn, hàng ngày chỉ cần thực hiện một phép xác định đơn lẻ trong dải quy định (xem 8.3).

8.3.3.3 Sau khi các mẫu hiệu chuẩn và các mẫu kiểm chứng đã nằm trong dải quy định, tiến hành phép xác định (8.4). Trong máy đo độ sáng (5.1), có thể cài đặt đến 10 kênh hiệu chuẩn riêng rẽ đối với các sản phẩm sữa khác nhau. Đọc kết quả của các phần mẫu thử nghiệm (7.1.2 và 7.1.4) trong kênh tương ứng với từng phần mẫu thử. Mẫu sữa nguyên liệu (7.1.3) được đọc trong kênh được hiệu chuẩn cho phần mẫu thử được sử dụng làm dịch pha loãng (7.2).

8.4 Xác định

8.4.1 Giới hạn bốn lọ cho mỗi phép thử. Dùng pipet cố định thể tích (5.3), lấy 100 ml cơ chất este dioxetan (4.1) cho vào bốn lọ nhỏ thử nghiệm (5.2), bốn lọ này đã được dán nhãn ở nửa phía trên của lọ.

8.4.2 Đối với tất cả các phần mẫu thử (7.1.1 đến 7.1.4), dùng pipet cố định thể tích (5.3), lấy 100 ml mẫu thử đã được chuẩn bị cho vào lượng chứa trong các lọ nhỏ (8.4.1), mỗi lần sử dụng một tip pipet mới.

...

...

...

8.4.4 Chọn kênh đo độ sáng thích hợp đã hiệu chuẩn cho phần mẫu thử. Sau 3 min, dùng bộ phận phân phối cố định thể tích (5.4) thêm 1,0 ml dung dịch hãm (4.2) trong vòng 15 s.

8.4.5 Lấy các lọ nhỏ này ra khỏi tủ ấm. Đậy nắp từng lọ. Lắc mạnh từng lọ trong 5 s. Tháo nắp lọ và gắn lọ vào bộ chuyển đổi của máy đo độ sáng, nếu cần. Đặt từng lọ vào máy đo độ sáng (5.1). Bật máy phân tích độ sáng và ghi lại kết quả sau các tiếng bíp. Lặp lại việc đếm với từng lo. Đối với phần mẫu thử cho giá trị cao hơn 7 000 mU/I thì pha loãng mẫu và lặp lại phép phân tích.

CHÚ THÍCH   Khi kết thúc phản ứng enzym, thì ánh sáng đầu ra là ổn định ở nhiệt độ từ 18^oC đến 24^oC trong 3 min. Số đọc của máy đo độ sáng tính theo đơn vị enzym mU/I.

8.5 Phép thử kiểm chứng phosphataza của vi khuẩn bền nhiệt

Nếu quy trình xác định (8.4) cho kết quả dương tính (³ 350 mU/I thường được sử dụng để nhận dạng các mẫu thanh trùng chưa đúng), thì tiến hành như sau:

Cho 1 ml phần mẫu khác (7.1.1 đến 7.1.4) vào các lọ nhỏ và gia nhiệt trong tủ ấm (5.7) hoặc trên nồi cách thủy (5.8) ở 63^oC. Giữ ở nhiệt độ này trong 30 min, sau đó làm nguội nhanh. Xác định hoạt độ phosphataza còn sót lại theo 8.4.

Hoạt độ còn sót lại là do sự có mặt phosphataza kiềm của vi khuẩn bền nhiệt. Nếu việc xác định mẫu thử đã gia nhiệt cho kết quả nằm trong khoảng 30% so với kết quả gốc thì toàn bộ hoạt độ phosphataza là vi khuẩn.

9. Tính và biểu thị kết quả

9.1 Khái quát

...

...

...

9.2 Cách tính thủ công

Ghi lại giá trị RLU (đơn vị ánh sáng tương đối) của các mẫu hiệu chuẩn làm việc A, B và C (4.3) và mẫu âm tính (7.2) và tính trung bình của các kết quả thu được (từ 8.1.1 đến 8.1.13).

Tính hoạt độ phosphataza kiềm bằng cách sử dụng hồi quy tuyến tính của các đơn vị ánh sáng tương đối của mẫu âm tính và của các mẫu hiệu chuẩn A, B và C, và hoạt độ phosphataza kiềm đích có liên quan (tính bằng mU/I) (ví dụ: mẫu kiểm chứng âm tính = 5 mU/I, A₁ = 44 mU/I hoặc A₂ = 88 mU/I, B₁ và B₂ = 175 mU/I, C₁ và C₂ = 350 mU/I).

Sử dụng giá trị RLU trung bình làm trục y và giá trị đích mU/I làm trục x. Tính độ dốc m và điểm cắt trục tung y, b, từ trùng khớp tuyến tính theo công thức (13) như sau:

y = mx + b                                            (13)

trong đó

x là hoạt độ phosphataza kiềm của mẫu, tính bằng mU/I;

m là giá trị độ dốc của đường hồi qui;

y là giá trị RLU của máy đo độ sáng;

...

...

...

Sử dụng các giá trị m và b tính được, việc xác định đơn vị enzym của phần mẫu thử có thể xác định được bằng cách sử dụng các giá trị RLU làm giá trị y và tính x (mU/I) bằng công thức (14) như sau:

x =                                              (14)

9.3 Biểu thị kết quả

Biểu thị kết quả đến đơn vị số nguyên gần nhất của mili đơn vị trên lít (mU/I).

10. Độ chụm

10.1 Phép thử liên phòng thử nghiệm

Các chi tiết của phép thử liên phòng thử nghiệm về độ chụm của phương pháp được đưa ra trong Phụ lục B. Các giá trị này được biểu thị ở mức xác xuất 95% và có thể không áp dụng được cho các dải nồng độ và các chất nền khác với các dải nồng độ và chất nền đã nêu.

Giới hạn lặp lại và giới hạn tái lặp được làm tròn trong 10.2 và 10.3 được áp dụng ở mức enzym (trung bình) của hoạt độ phosphataza xấp xỉ 50 mU/I và 100 mU/I và dao động từ 350 mU/I đến 2500 mU/I.

10.2 Độ lặp lại

...

...

...

- đối với các mức enzym từ 350 mU/I đến 2500 mU/I                 21 % giá trị trung bình;

- đối với các mức enzym xấp xỉ 100 mU/I                                 30 mU/I;

- đối với các mức enzym xấp xỉ 50 mU/I                                   18 mU/I;

- đối với các mức enzym từ các mẫu âm tính                           6 mU/I.

10.3 Độ tái lập

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử riêng rẽ thu được khi áp dụng cùng một phương pháp, tiến hành trên cùng mẫu thử, thực hiện trong các phòng thử nghiệm khác nhau, do các kỹ thuật viên khác nhau thực hiện, sử dụng các thiết bị khác nhau, không được quá 5% các trường hợp lớn hơn:

- đối với các mức enzym từ 350 mU/I đến 2500 mU/I                 41 % giá trị trung bình;

- đối với các mức enzym xấp xỉ 100 mU/I                                 50 mU/I;

- đối với các mức enzym xấp xỉ 50 mU/I                                   34 mU/I;

...

...

...

11. Báo cáo thử nghiệm

Báo các thử nghiệm phải ghi rõ:

a) mọi thông tin cần thiết về nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

c) phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) tất cả các điều kiện thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc được xem là tùy ý, cùng với mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả.

e) kết quả thử nghiệm thu được hoặc nếu đáp ứng yêu cầu về độ lặp lại thì ghi kết quả cuối cùng thu được.

Phụ lục A

...

...

...

Sơ đồ quy trình

Phụ lục B

(tham khảo)

Kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm

Các giá trị giới hạn lặp lại và giới hạn tái lặp thu được từ các kết quả của một phép thử liên phòng thử nghiệm bao gồm 15 phòng thử nghiệm từ 8 quốc gia (Úc, Canada, Pháp, Ailen, Israel, Niuzilan, Anh và Mỹ) đã tham gia thực hiện theo TCVN 6910-1 (ISO 5725-1) và TCVN 6910-2 (ISO 5725-2) và đã kết thúc vào tháng 4 năm 2005.

CHÚ THÍCH   Các kết quả đã thống nhất trước khi nghiên cứu sơ bộ và nghiên cứu cộng tác năm 2003 và 2004 đối với đồ uống từ sữa bò mà đã được xuất bản trong Tạp chí IDF.

Nghiên cứu này đã đánh giá sữa của nhiều loài (bò, dê, cừu và trâu) cũng như sữa gầy (< 0,5 % chất béo), cream 20% và socola với 2% sữa (tất cả đều tính theo khối lượng). Các kết quả thu được đã đưa vào phân tích thống kê theo TCVN 6910-2 (ISO 5725-2) đưa ra các dữ liệu về độ chụm trong Bảng B.1 và B.2, đối với giá trị trung bình của enzym được nêu trong Bảng B.3. Các giá trị độ lệch chuẩn s_r và s_R đối với các giá trị âm tính và hệ số biến thiên của các giá trị trung bình tại mỗi mức enzym nghiên cứu, CV(_r) và CV(_R) được nêu trong Bảng B.4.

Các giới hạn lặp lại và tái lập (xem điều 10) là các giá trung bình r và R đối với các chất nền đa dạng và các giá trị trung bình của r và R là các giá trị tính theo phần trăm. Các kết quả được xuất bản trong [7]. Giới hạn phát hiện của phương pháp tính được từ trung bình tổng thể cộng với 3 s_R là 20 mU/I.

...

...

...

Sản phẩm từ sữa

Mức enzym đích ^a (mU/I)

Âm tính

50

100

350

500

Sữa bò nguyên chất

14,1

...

...

...

37,8

126,1

95,4

Sữa dê nguyên chất

5,7

13,5

22,8

56,6

68,6

...

...

...

0,6

18,0

28,2

81,4

76,3

Sữa trâu nguyên chất

1,5

12,5

21,0

...

...

...

158,7

Sữa bò gầy

2,9

12,4

14,3

40,8

88,2

20 % cream

5,1

...

...

...

22,9

43,9

48,8

Có bổ sung hương liệu (socola, 2 % sữa)

9,3

36,0

62,2

60,9

150,6

...

...

...

5,6

17,7

29,9

65,5

98,1

^a là chênh lệch tuyệt đối của các mẫu giống hệt nhau được thử nghiệm trong cùng một phòng thử nghiệm, trong một khoảng thời gian ngắn không quá 5% trường hợp vượt quá giá trị đã nêu.

Bảng B.2 - Giá trị tái lập (R) của các mức enzym đích thu được từ phép thử năm 2005

Sản phẩm từ sữa

Mức enzym đích ^a (mU/I)

...

...

...

50

100

350

500

Sữa bò nguyên chất

40,8

40,3

45,9

156,6

...

...

...

Sữa dê nguyên chất

19,0

26,1

53,1

138,6

171,9

Sữa cừu nguyên chất

6,8

51,3

...

...

...

194,2

225,0

Sữa trâu nguyên chất

3,5

20,5

30,0

100,7

217,6

Sữa bò gầy

...

...

...

22,4

38,6

81,0

127,8

20 % cream

13,3

26,6

38,0

112,5

...

...

...

Có bổ sung hương liệu (socola, 2 % sữa)

10,5

51,2

84,5

131,5

244,3

Giá trị R trung bình

13,8

34,1

...

...

...

130,7

194,4

^a là chênh lệch tuyệt đối của các mẫu giống hệt nhau được thử nghiệm trong các phòng thử nghiệm khác nhau, trong một khoảng thời gian ngắn không quá 5% trường hợp vượt quá giá trị đã nêu.

Bảng B.3 - Giá trị trung bình của enzym (mU/I) đối với mỗi mức nghiên cứu trong mỗi chất nền

Sản phẩm từ sữa

Mức enzym đích (mU/I)

Âm tính

50

100

...

...

...

500

Sữa bò nguyên chất

17

58

110

325

451

Sữa dê nguyên chất

5

...

...

...

92

340

486

Sữa cừu nguyên chất

1

43

80

335

475

...

...

...

1

48

90

330

529

Sữa bò gầy

1

53

100

...

...

...

371

20 % cream

6

61

111

337

475

Có bổ sung hương liệu (socola, 2 % sữa)

2

...

...

...

117

307

412

Giá trị trung bình

4,7

50,7

100,0

323,2

456,8

...

...

...

(ngoại trừ các mẫu âm tính)

Sản phẩm từ sữa

Mức enzym đích (mU/I)

Âm tính

50

100

350

500

Sr

...

...

...

SR

(mU/I)

CV(r)

%

CV(R)

%

CV(r)

%

CV(R)

...

...

...

CV(r)

%

CV(R)

%

CV(r)

%

CV(R)

%

Sữa bò nguyên chất

...

...

...

14,6

9,8

24,8

12,3

14,9

13,8

17,2

7,6

15,4

...

...

...

2,0

6,8

12,4

24,1

8,8

20,6

5,9

14,6

5,0

...

...

...

Sữa cừu nguyên chất

0,2

2,4

15,0

42,7

12,5

27,2

8,7

20,7

...

...

...

16,9

Sữa trâu nguyên chất

0,5

1,2

9,2

15,1

8,3

11,9

5,3

...

...

...

10,7

14,7

Sữa bò gầy

1,0

1,1

8,2

15,3

5,1

13,8

...

...

...

10,0

8,5

12,3

20 % cream

1,8

4,8

9,2

15,5

7,4

...

...

...

4,7

11,9

3,7

13,5

Có bổ sung hương liệu (socola, 2 % sữa)

3,3

3,7

24,2

34,5

...

...

...

25,9

7,1

15,3

13,1

21,2

Giá trị R trung bình

2,0

4,9

12,6

...

...

...

10,5

18,1

7,2

14,4

7,8

15,2

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] TCVN 6400 (ISO 707), Sữa và sản phẩm sữa - Hướng dẫn lấy mẫu.

...

...

...

[3] TCVN 6910-2 : 2001 (ISO 5725-2 : 1994). Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo. Phần 2: Phương pháp cơ bản xác định độ lặp lại và độ tái lặp của phương pháp đo tiêu chuẩn.

[4] TCVN 6506 : 2007 (ISO 11816-1 : 2006) Sữa và sản phẩm sữa - Xác định hoạt độ phosphataza kiềm - Phần 1 - Phương pháp Đo huỳnh quang đối với sữa và đồ uống từ sữa.

[5] ISO 11816-2 : 2003, Milk and milk products - Determination of alkaline phosphataza activity - Part 2: Fluorometric method for cheese.

[6] International Union of Blochemistry Nomenclature. J. Am. Med. Assoc., 260, 1988, p.73.

[7] J.AOAC International, 89, 2006, p. 1061.