5.3.1.2. Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần cơ bản hoặc môi trường cơ bản hoàn chỉnh khô trong nước, bằng cách đun đến sôi. Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH là 7,4 ± 0,2 ở 25 °C, nếu cần. Phân phối môi trường cơ bản vào bình cầu có dung tích thích hợp. Khử trùng 15 min trong nồi hấp áp lực (6.1) ở 121 °C.

5.3.2. Dung dịch kháng sinh

5.3.2.1. Thành phần

Xefoperazon                                                                                                               0,032 g

Amphoterixin B                                                                                                             0,01 g

Nước                                                                                                                               5 ml

5.3.2.2. Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trong nước. Lọc để khử trùng.

...

...

...

5.3.3.1. Thành phần

Môi trường cơ bản (5.3.1)                                                                                           1 000 ml

Dung dịch kháng sinh (5.3.2)                                                                                             5 ml

5.3.3.2. Chuẩn bị

Cho dung dịch kháng sinh vào môi trường cơ bản, đã làm nguội đến 47 °C ± 2 °C, trộn đều. Rót khoảng 15 ml môi trường hoàn chỉnh vào các đĩa Petri vô trùng (6.8). Để cho đông đặc. Ngay trước khi sử dụng, làm khô cẩn thận các đĩa thạch, tốt nhất là mở nắp và để mặt thạch úp xuống phía dưới, để vào tủ sấy (6.2) trong 30 min hoặc cho đến khi bề mặt thạch khô. Nếu đã chuẩn bị trước thì các đĩa thạch chưa khô không để quá 4 h ở nhiệt độ phòng, hoặc nếu bảo quản ở nơi tối với nhiệt độ 5 °C ± 3 °C thì không quá 7 ngày.

5.3.3.3. Kiểm tra tính năng

Đối với việc xác định tính chọn lọc và hiệu quả, xem ISO/TS 11133-1. Đối với các tiêu chí thực hiện, xem Bảng B.5 của ISO/TS 11133-2 : 2003.

5.4. Thạch huyết Columbia

5.4.1. Môi trường cơ bản

...

...

...

Dịch thủy phân mô động vật bằng enzym                                                                       23,0 g

Tinh bột                                                                                                                          1,0 g

Natri clorua                                                                                                                     5,0 g

Thạch                                                                                                          8,0 g đến 18,0 g ^a

Nước                                                                                                                        1 000 ml

^a Tùy thuộc vào sức đông của thạch.

5.4.1.2. Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần cơ bản hoặc môi trường cơ bản hoàn chỉnh khô trong nước, bằng cách đun đến sôi. Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH là 7,3 ± 0,2 ở 25 °C, nếu cần. Phân phối môi trường cơ bản vào bình cầu có dung tích thích hợp. Khử trùng 15 min trong nồi hấp áp lực (6.1) ở 121 °C.

5.4.2. Huyết cừu vô trùng đã khử fibrin

...

...

...

5.4.3.1. Thành phần

Môi trường cơ bản (5.4.1)                                                                                          1 000 ml

Huyết cừu vô trùng đã khử fibrin (5.4.2)                                                                          50 ml

5.4.3.2. Chuẩn bị

Cho huyết cừu một cách vô trùng vào môi trường cơ bản, đã làm nguội đến 47 °C ± 2 °C, trộn đều. Rót khoảng 15 ml môi trường hoàn chỉnh vào các đĩa Petri vô trùng (6.8). Để cho đông đặc. Ngay trước khi sử dụng, làm khô cẩn thận các đĩa thạch, tốt nhất là mở nắp và để mặt thạch úp xuống phía dưới, để vào tủ sấy (6.2) trong 30 min hoặc cho đến khi bề mặt thạch khô. Nếu đã chuẩn bị trước thì các đĩa thạch chưa khô không để quá 4 h ở nhiệt độ phòng, hoặc nếu bảo quản ở nơi tối với nhiệt độ 5 °C ± 3 °C thì không quá 7 ngày.

5.4.3.3. Kiểm tra tính năng

Để xác định tính chọn lọc và hiệu suất, xem ISO/TS 11133-1.

Để kiểm tra tính năng, xem ISO/TS 11133-2. Các chủng kiểm chứng C.coli ATCC 43478 hoặc C.jejuni ATCC 33291 phải cho thấy mọc tốt trên thạch huyết Columbia sau khi ủ vi hiếu khí trong 24 h ở 37 °C.

5.5. Canh thang Brucella

...

...

...

Dịch thủy phân casein bằng enzym                                                                                10,0 g

Dịch thủy phân mô động vật bằng enzym                                                                       10,0 g

Glucoza                                                                                                                          1,0 g

Cao men                                                                                                                         2,0 g

Natri clorua                                                                                                                     5,0 g

Natri hydrosulfit                                                                                                              0,1 g

Nước                                                                                                                        1 000 ml

5.5.2. Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần cơ bản hoặc môi trường cơ bản hoàn chỉnh khô trong nước, bằng cách đun nóng, nếu cần. Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH là 7,0 ± 0,2 ở 25 °C, nếu cần. Phân phối môi trường cơ bản này với các lượng 10 ml vào các ống nghiệm có dung tích thích hợp. Khử trùng 15 min trong nồi hấp áp lực (6.1) ở 121 °C.

...

...

...

Đối với việc xác định tính chọn lọc và hiệu suất, xem ISO/TS 11133-1. Đối với các tiêu chí thực hiện, xem Bảng B.4 của ISO/TS 11133-2 : 2003.

5.6. Thuốc thử phát hiện oxidaza

5.6.1. Thành phần

N,N,N’,N’-Tetrametyl-1,4-phenylenediamin dihydro clorua                                                   1,0 g

Nước                                                                                                                            100 ml

5.6.2. Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trên vào nước ngay trước khi sử dụng.

6. Thiết bị và dụng cụ thủy tinh

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm vi sinh thông thường [xem TCVN 6404 (ISO 7218)] và cụ thể như sau:

...

...

...

Xem TCVN 6404 (ISO 7218).

6.2. Tủ sấy được đối lưu không khí hoặc tủ ấm, có khả năng hoạt động ở nhiệt độ từ 37 °C đến 55 °C.

6.3. Tủ ấm, có khả năng hoạt động ở 41,5 °C ± 1 °C.

6.4. Tủ ấm, có khả năng hoạt động ở 25 °C ± 1 °C.

6.5. Nồi cách thủy, có khả năng hoạt động ở nhiệt độ từ 44 °C đến 47 °C.

6.6. Máy đo pH, có độ chính xác đến 0,1 đơn vị pH ở 25 °C.

6.7. Dụng cụ chứa, ví dụ như các chai, ống nghiệm, bình cầu thích hợp cho việc khử trùng và bảo quản dịch pha loãng và môi trường cấy.

6.8. Đĩa Petri, tốt nhất là bằng thủy tinh hoặc chất dẻo có khấc, đường kính từ 90 mm đến 100 mm.

6.9. Pipet chia độ xả hết, dung tích danh định 1 ml và 10 ml được chia độ đến 0,1 ml, có lỗ xả rộng.

...

...

...

6.11. Que cấy vòng, bằng platin/iridi hoặc niken/crom hoặc bằng chất dẻo, đường kính khoảng 3 mm và vòng cấy cùng chất liệu, hoặc đũa thủy tinh hoặc chất dẻo.

CHÚ THÍCH: Vòng niken/crom không thích hợp để sử dụng trong phép thử oxidaza (xem 9.4.3).

6.12. Que dàn mẫu, bằng thủy tinh hoặc chất dẻo.

6.13. Kính hiển vi, tốt nhất là loại có phản pha (để quan sát tính di động đặc trưng của Campylobacter).

6.14. Thiết bị thích hợp để đạt được môi trường vi hiếu khí, với hàm lượng oxi là 5 % ± 2 %, cacbon dioxit 10 % ± 3 %, hydro tùy chọn ≤ 10 %, có lượng nitơ cân bằng. Sử dụng các vật chứa kín khí để giữ đĩa Petri, ví dụ như các bình yếm khí. Môi trường vi hiếu khí khí thích hợp có thể thu được bằng cách sử dụng các bộ kit thử sinh khí có bán sẵn (tuân thủ hướng dẫn của nhà sản xuất một cách chính xác, đặc biệt là liên quan đến thể tích của bình và dung tích của kit thử sinh khí). Cách khác, xịt bình bằng hỗn hợp khí thích hợp trước khi ủ.

7. Lấy mẫu

Điều quan trọng là mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải đúng là mẫu đại diện và không bị hư hỏng hay biến đổi trong quá trình vận chuyển hoặc bảo quản. Việc lấy mẫu không qui định trong tiêu chuẩn này. Xem tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm. Nếu không có tiêu chuẩn riêng liên quan đến việc lấy mẫu sản phẩm thì các bên liên quan nên thỏa thuận với nhau về vấn đề này.

Vì các loài Campylobacter spp. rất nhạy với việc đóng băng nhưng lại tồn tại rất tốt ở nhiệt độ thấp, nên các mẫu thử không được làm đông lạnh mà phải bảo quản ở + 3 °C ± 2 °C và nên phân tích càng nhanh càng tốt. Cần chú ý không làm mẫu khô.

8. Chuẩn bị mẫu thử

...

...

...

9. Cách tiến hành

9.1. Phần mẫu thử, huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng

Xem TCVN 6507 (ISO 6887) và tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm.

Chuẩn bị một dãy dung dịch pha loãng thập phân đơn lẻ từ mẫu thử nếu sản phẩm ở dạng lỏng hoặc từ huyền phù ban đầu nếu sản phẩm ở dạng khác.

9.2. Cấy và ủ

9.2.1. Dùng pipet vô trùng (6.9), chuyển vào hai đĩa đựng môi trường thạch mCCD (5.3), mỗi đĩa 0,1 ml huyền phù ban đầu (9.1). Dùng que dàn mẫu vô trùng (6.12) dàn cẩn thận dịch cấy càng nhanh càng tốt, không để chạm vào mép đĩa, cho đến khi không còn thấy dịch lỏng trên bề mặt thạch và đậy nắp đĩa.

Lặp lại thao tác này với các dung dịch pha loãng thập phân tiếp theo, nếu cần.

Đối với một số sản phẩm nhất định, khi cần phải định lượng một số lượng nhỏ Campylobacter, thì giới hạn định lượng có thể nhỏ đi 10 lần bằng cách kiểm tra 1,0 ml huyền phù ban đầu. Phân phối 1 ml dịch cấy lên môi trường thạch trên đĩa Petri to (140 mm) hoặc trên bề mặt môi trường thạch trong ba đĩa nhỏ (90 mm), sử dụng que dàn mẫu vô trùng (6.12). Trong cả hai trường hợp, chuẩn bị các bộ đĩa kép bằng cách dùng hai đĩa to hoặc sáu đĩa nhỏ.

9.2.2. Ủ các đĩa này (9.2.1) ở 41,5 °C từ 40 h đến 48 h trong môi trường vi hiếu khí (6.14).

...

...

...

9.3.1. Trên thạch mCCD các khuẩn lạc điển hình có màu xám, thường có lấp lánh ánh kim loại, phẳng và ướt có xu hướng mọc lan tỏa. Các khuẩn lạc lan tỏa ít trên các bề mặt thạch khô. Có thể xuất hiện các khuẩn lạc có dạng khác.

Chọn các đĩa (9.2.2) chứa ít hơn 150 khuẩn lạc điển hình hoặc nghi ngờ và đếm các khuẩn lạc đó. Chọn ngẫu nhiên năm khuẩn lạc như thế và cấy truyền để thử khẳng định (9.4).

9.3.2. Cấy vạch từng khuẩn lạc đã chọn (9.3.1) lên đĩa thạch huyết Columbia (5.4) để cho phát triển thành các khuẩn lạc riêng biệt. Ủ các đĩa này trong môi trường vi hiếu khí ở 41,5 °C trong 24 h đến 48 h. Sử dụng các khuẩn lạc thuần khiết để kiểm tra hình thái, tính di động, mọc trong điều kiện vi hiếu khí ở 25 °C, mọc hiếu khí ở 41,5 °C và có mặt của oxidaza.

9.4. Khẳng định các loài Campylobacter

Vì vi khuẩn suy giảm chất lượng rất nhanh trong không khí, do đó các qui trình mô tả trong 9.4.1 đến 9.4.3 cần được thực hiện ngay.

9.4.1. Kiểm tra hình thái và tính di động

9.4.1.1. Hòa một khuẩn lạc từ đĩa thạch huyết Columbia (9.3.2) vào 1 ml canh thang Brucella (5.5) và sử dụng kính hiển vi (6.13) để kiểm tra về hình thái và tính di động.

9.4.1.2. Giữ tất cả các khuẩn lạc (9.3.2) được tìm thấy (9.4.1.1) để kiểm tra tiếp theo, trong đó các trực khuẩn uốn cong có di động xoáy “mở nút chai”.

9.4.2. Nghiên cứu sự phát triển ở 25 °C (vi hiếu khí) và 41,5 °C (hiếu khí)

...

...

...

Ủ một đĩa ở 25 °C trong môi trường vi hiếu khí (6.14) từ 40 h đến 48 h. Đĩa còn lại ủ trong môi trường hiếu khí ở 41,5 °C từ 40 h đến 48 h.

Kiểm tra các đĩa về sự phát triển của khuẩn lạc Campylobacter mà có thể nhìn thấy được.

9.4.3. Phát hiện oxidaza

Dùng vòng cấy hoặc que cấy bằng platin/iridi hoặc đũa thủy tinh (6.11), lấy một phần của mỗi khuẩn lạc được tách biệt rõ (9.4.1.2) và ria cấy lên giấy lọc đã được làm ẩm bằng thuốc thử oxidaza (5.6). Viền ngoài có màu tím hoa cà, màu tím hoặc màu xanh đậm trong 10 s chứng tỏ phản ứng dương tính. Nếu sử dụng kit thử oxidaza có bán sẵn thì tuân theo chỉ dẫn của nhà sản xuất.

Khẳng định các kết quả sử dụng các kiểm chứng dương tính và âm tính. Các ví dụ về các chủng kiểm chứng thích hợp là Pseudomonas aeruginosa NCTC 10662 (kiểm chứng dương tính), Escherichia coli NCTC 9001 (kiểm chứng âm tính).

9.4.4. Diễn giải kết quả

Campylobacter spp. cho các kết quả như trong Bảng 1.

Bảng 1 - Các đặc trưng của Campylobacter spp.

Hình thái học (9.4.1)

...

...

...

Tính di động (9.4.1)

đặc trưng

Mọc trong môi trường vi hiếu khí ở 25 °C (9.4.2)

-

Mọc trong môi trường hiếu khí ở 41,5 °C (9.4.2)

-

Oxidaza (9.4.3)

+

10. Biểu thị kết quả

...

...

...

10.1.1. Nếu ít nhất 80 % các khuẩn lạc được chọn đã được khẳng định (9.4.4), thì số lượng Campylobacter là số đếm được như trong 9.3.

10.1.2. Trong tất cả các trường hợp khác, tính số lượng Campylobacter thu được như trong 9.3 được khẳng định (9.4.4). Làm tròn kết quả đến số nguyên.

10.2. Phương pháp tính

10.2.1. Trường hợp chung - Các đĩa chứa từ 15 khuẩn lạc đến 150 khuẩn lạc Campylobacter giả định

Số lượng N của Campylobacter có mặt trong mẫu thử là số trung bình của hai độ pha loãng liên tiếp, sử dụng công thức (1):

                                                          (1)

trong đó:

Sa là tổng các khuẩn lạc phù hợp với các tiêu chí nhận dạng, đếm được trên tất cả các đĩa được giữ lại từ hai độ pha loãng liên tiếp và trong đó ít nhất một đĩa có chứa tối thiểu 15 khuẩn lạc.

V là thể tích dịch cấy trên mỗi đĩa, tính bằng mililit;

...

...

...

n₂ là số đĩa được giữ lại ở độ pha loãng thứ hai;

d là hệ số pha loãng tương ứng với độ pha loãng thứ nhất được giữ lại [d = 1 khi sản phẩm ở dạng lỏng (mẫu thử) không pha loãng].

Làm tròn số các kết quả thu được đến hai chữ số có nghĩa. Để làm tròn, nếu chữ số thứ ba nhỏ hơn 5 thì không thay đổi chữ số đứng trước nó; nếu chữ số thứ ba lớn hơn hoặc bằng 5 thì tăng chữ số đứng trước lên một đơn vị.

Lấy kết quả là số thích hợp giữa 1,0 và 9,9 nhân với lũy thừa tương ứng của 10, hoặc làm tròn số với hai chữ số có nghĩa.

Biểu thị kết quả như sau:

Số N ước tính của Campylobacter có trong một mililit (sản phẩm ở dạng lỏng) hoặc một gam (sản phẩm ở dạng khác).

Ví dụ: Số đếm có được các kết quả như sau:

- ở độ pha loãng thứ nhất (10 ^-2) được giữ lại: 66 khuẩn lạc và 80 khuẩn lạc;

- ở độ pha loãng thứ hai (10 ^-3) được giữ lại: 4 khuẩn lạc và 7 khuẩn lạc.

...

...

...

- đối với 66 khuẩn lạc: 4 trong 5 khuẩn lạc phù hợp với các tiêu chí, cho a = 66 (xem 10.1.1)

- đối với 80 khuẩn lạc: 3 trong 5 khuẩn lạc phù hợp với các tiêu chí, cho a = 48

- đối với 7 khuẩn lạc: 4 trong 5 khuẩn lạc phù hợp với các tiêu chí, cho a = 7

- đối với 4 khuẩn lạc: tất cả 4 khuẩn lạc đều được khẳng định.

Làm tròn kết quả, số Campylobacter có trong một mililit hoặc một gam sản phẩm là 570 00 hoặc 5,7 x 10⁴.

10.2.2. Trường hợp có hai đĩa chứa ít hơn 15 khuẩn lạc

Nếu hai đĩa mẫu thử (sản phẩm ở dạng lỏng) hoặc huyền phù ban đầu (sản phẩm ở dạng khác), hoặc từ độ pha loãng thứ nhất đã cấy hoặc được giữ lại, chứa ít hơn 15 khuẩn lạc điển hình, thì tính số ước tính N_E của Campylobacter có mặt trong mẫu thử là giá trị trung bình số học, của các khuẩn lạc đếm được trên hai đĩa, theo công thức (2):

                                                                          (2)

...

...

...

Sa là tổng số khuẩn lạc đếm được trên hai đĩa;

V là thể tích dịch cấy đã cấy trên mỗi đĩa, tính bằng mililit;

n là số đĩa được giữ lại (trong trường hợp này n = 2);

d là hệ số pha loãng của huyền phù ban đầu hoặc của độ pha loãng thứ nhất đã được cấy [d = 1 khi sản phẩm ở dạng lỏng (mẫu thử) không pha loãng]. Biểu thị kết quả như sau:

số lượng vi sinh vật ước tính là N Campylobacter trong một mililit (đối với sản phẩm ở dạng lỏng) hoặc trong một miligam (sản phẩm ở dạng khác).

Ví dụ: Số đếm có được từ các kết quả sau đây:

- ở độ pha loãng thứ nhất (10^-1) được giữ lại: 12 khuẩn lạc và 13 khuẩn lạc đếm được:

Làm tròn kết quả theo 10.2.1, số lượng vi sinh vật ước tính N của Campylobacter là 1300 hoặc 1,3 x 10³ trong một mililit hoặc trong một gam sản phẩm.

...

...

...

Nếu hai đĩa của mẫu thử (sản phẩm ở dạng lỏng) hoặc huyền phù ban đầu (sản phẩm ở dạng khác) hoặc từ độ pha loãng thứ nhất đã cấy hoặc giữ lại không chứa khuẩn lạc nào, thì biểu thị kết quả như sau:

ít hơn 1/d x V Campylobacter trong một mililit (sản phẩm ở dạng lỏng) hoặc trong một gam (sản phẩm ở dạng khác);

trong đó:

d là hệ số pha loãng của huyền phù ban đầu hoặc độ pha loãng thứ nhất đã cấy hoặc được giữ lại [d = 10 ⁰= 1 khi mẫu thử (dạng lỏng) đã cấy trực tiếp được giữ lại];

V là thể tích dịch cấy đã cấy lên các đĩa, tính bằng mililit.

10.2.4. Trường hợp đặc biệt

Các trường hợp đặc biệt được nêu trong TCVN 6404 (ISO 7218).

10.3. Độ chụm

Theo các lý do thống kê, trong 95 % các trường hợp thì các giới hạn tin cậy của kỹ thuật đếm khuẩn lạc dao động từ ± 16 % đến 52 % [3]. Đối với các số đếm khuẩn lạc nhỏ hơn 15 khuẩn lạc trên một đĩa, thì giới hạn tin cậy được đưa ra trong Phụ lục A. Trong thực tế, ngay cả khi dao động lớn hơn cũng có thể gặp phải, đặc biệt là các kết quả thu được từ nhiều người khác nhau thực hiện.

...

...

...

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

c) phương pháp thử và nhiệt độ ủ đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) mọi chi tiết thao tác không qui định trong tiêu chuẩn này, hoặc tùy lựa chọn, cùng với các chi tiết bất thường khác có thể ảnh hưởng tới kết quả;

e) các kết quả thử nghiệm thu được.

Phụ lục A

(Qui định)

...

...

...

Các giới hạn tin cậy ở mức 95 % đối với việc ước tính số lượng nhỏ các khuẩn lạc, khi số khuẩn lạc được giữ lại nhỏ hơn 15, được nêu trong Bảng A.1.

Bảng A.1

Số lượng vi sinh vật

Giới hạn tin cậy ở mức 95 %

dưới

trên

1

< 1

2

...

...

...

< 1

4

3

< 1

5

4

1

6

5

...

...

...

9

6

2

10

7

2

12

8

3

...

...

...

9

4

14

10

4

16

11

5

18

...

...

...

6

19

13

7

20

14

7

21

15

...

...

...

23

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] BOLTON, F.J. et al. A blood-free selective medium for the isolation of Campylobacter jejuni from faeces. J. Clin. Microbiol. 19, 1984, pp. 169-171

[2] CORRY, J.E.L. et al. (eds). Handbook of culture media for food microbiology. Progress in Industrial Microbiology. Vol. 37, Elsevier, Amsterdam, 2003

[3] COWELL N.D. and MORISETTI M.D. J. Sci. Fd. Agric. 20, 1969, p.573

[4] HUNT, J.M. et al. Campylobacter. In: Food and Drug Administration Bacteriological Analytical Manual, 8^th edition, AOAC, Arlington VA, USA, 1998

[5] HUTCHINSON, D.N. and BOLTON, F.J. Improved blood-free selective medium for the isolation of Campylobacter jejuni from faecal specimen. J. Clin. Pathol. 37, 1984, pp. 956-957