Có mặt các Campylobacter spp. nếu có ít nhất một khuẩn lạc cho thấy các đặc trưng ở trên.

9.5. Nhận dạng các loài Campylobacter (tùy chọn)

9.5.1. Khái quát

Trong số các Campylobacter phát triển ở 41,5 °C, các loài thường gặp nhất là Campylobacter jejuni và Campylobacter coli. Tuy nhiên, các loài khác thường gặp được mô tả (Campylobacter lari, Campylobacter upsaliensis và một số loài khác); các đặc trưng được nêu trong Bảng 2 cho phép phân biệt chúng.

9.5.2. Phát hiện catalaza

Đối với mỗi khuẩn lạc được chọn trong 9.4.2.2, nhúng một vòng dịch cấy vào một giọt dung dịch hydro peroxit (5.4.4) lên một lam kính sạch.

Phép thử được coi là dương tính nếu bọt bong bóng xuất hiện trong vòng 30 s.

Khẳng định các kết quả sử dụng các kiểm chứng dương tính và âm tính. Các ví dụ về các chủng kiểm chứng thích hợp là Staphylococcus aureus NCTC 8532 (kiểm chứng dương tính), Enterococus faecalis NCTC 775 (kiểm chứng âm tính).

9.5.3. Phát hiện độ nhạy với axit nalidixic và xephalotin

...

...

...

Pha loãng huyền phù này với tỷ lệ 1/10 sử dụng cùng một canh thang.

Phủ ngập một lớp huyền phù lên bề mặt đĩa thạch huyết Hinton Mueller 5 % (5.4.6).

Để cho tiếp xúc 5 phút, sau đó để ráo huyền phù.

Sấy khô đĩa 10 phút trong tủ sấy (6.2) để ở 37 °C.

Đặt đĩa axit nalidixic và đĩa xephalotin (5.4.7) lên mặt đĩa thạch.

Ủ các đĩa với nắp lật úp, ở 37 °C trong 22 h ± 2 h trong môi trường vi hiếu khí (6.14).

Diễn giải kết quả về sự phát triển vi khuẩn theo cách sau đây:

- phát triển trong vùng tiếp xúc với đĩa được phân loại là bền vững (có khả năng đề kháng);

- có mặt một vùng ức chế với mọi kích cỡ được phân loại là có khả năng cảm nhận.

...

...

...

Đối với mỗi khuẩn lạc được chọn trong 9.4.2.2, sử dụng que cấy vòng (6.11) lấy một vòng dịch cấy để chuẩn bị huyền phù trong ống phân giải huyết (6.7) chứa 0,4 ml dung dịch natri hipurat (5.4.5), chú ý không được để lẫn thạch.

Lắc để trộn kỹ và ủ 2 h trong nồi cách thủy (6.4) để ở 37 °C hoặc ủ ấm 4 h ở 37 °C.

Cẩn thận thêm 0,2 ml dung dịch ninhydrin (5.4.5) lên đỉnh của dung dịch natri hipurat. Không lắc.

Diễn giải kết quả sau khi ủ thêm 10 min trên nồi cách thủy (6.4) hoặc để trong tủ ấm ở 37 °C.

Màu tím đậm chứng tỏ phản ứng dương tính.

Màu tím nhạt hoặc không đổi màu chứng tỏ phản ứng âm tính.

Khẳng định các kết quả sử dụng các kiểm chứng dương tính và âm tính. Ví dụ về các chủng kiểm chứng thích hợp là Campylobacter jejuni NCTC 11351 (kiểm chứng dương tính), Campylobacter coli NCTC 11366 (kiểm chứng âm tính).

9.5.5. Phát hiện thủy phân indoxyl axetat

Cho một khuẩn lạc được chọn trong 9.4.2.2 lên đĩa indoxyl axetat (5.4.8) và thêm một giọt nước cất vô trùng. Để phản ứng được rõ ràng, cần sử dụng một vòng đầy các khuẩn lạc.

...

...

...

Khẳng định các kết quả sử dụng các kiểm chứng dương tính và âm tính. Các ví dụ về các chủng kiểm chứng thích hợp là Campylobacter jejuni NCTC 11351 (kiểm chứng dương tính), Campylobacter lari NCTC 11352 (kiểm chứng âm tính).

9.5.6. Diễn giải

Các loài Campylobacter phát triển ở 41,5 °C có thể được nhận dạng theo Bảng 2.

Bảng 2 - Đặc trưng của các loài campylobacter

Đặc trưng

C.jejuni

C.coli

C.lari

C.upsaliensis

...

...

...

+

+

+

- hoặc nhẹ

Axit nalidixic (9.5.3)

S^a

S^a

R/S^b

S

...

...

...

R

R

R

S

Thủy phân hipurat (9.5.4)

+

-

-

-

...

...

...

+

+

-

+

Chú giải: + = dương tính; S = nhạy; R = bền và - = âm tính

^a Cho thấy tăng bền vững với axit nalidixic của các chủng C.jejuni và C.coli

^b Tồn tại C.lari vừa nhạy vừa bền.

10. Biểu thị kết quả

Theo phần diễn giải các kết quả, nêu rõ sự có mặt hay không có mặt Campylobacter trong phần mẫu thử x g hoặc x ml sản phẩm. [xem TCVN 6404 (ISO 7218)].

...

...

...

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

c) mọi sai lệch trong môi trường tăng sinh hoặc môi trường phân lập thứ nhất hoặc các điều kiện ủ đã sử dụng;

d) môi trường phân lập thứ hai đã sử dụng;

e) mọi chi tiết thao tác không qui định trong tiêu chuẩn này, hoặc tùy lựa chọn, cùng với các chi tiết bất thường khác có thể ảnh hưởng tới kết quả;

f) các kết quả thử nghiệm thu được.

Phụ lục A

...

...

...

Sơ đồ qui trình

Phụ lục B

(Qui định)

Thành phần và chuẩn bị môi trường nuôi cấy và thuốc thử

B.1. Canh thang Bolton

B.1.1. Môi trường cơ bản

B.1.1.1. Thành phần

Dịch thủy phân mô động vật bằng enzym                       10,0 g

...

...

...

Cao men                                                                       5,0 g

Natri clorua                                                                   5,0 g

Natri pyruvat                                                                 0,5 g

Natri metabisulphit                                                         0,5 g

Natri cacbonat                                                               0,6 g

Axit a-Ketoglutaric                                                         1,0 g

Haemin (được hòa tan trong natri hydroxit 0,1 %)           0,01 g

Nước                                                                            1 000 ml

B.1.1.2. Chuẩn bị

...

...

...

Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH của môi trường hoàn chỉnh là 7,4 ± 0,2 ở 25 °C, nếu cần. Phân phối môi trường cơ bản vào các bình cầu có dung tích thích hợp. Khử trùng môi trường 15 min ở 121 °C trong nồi hấp áp lực (6.1).

B.1.2. Huyết ngựa đã khử fibrin phân giải vô trùng

Sử dụng huyết ngựa đã phân giải saponin hoặc được phân giải bằng cấp đông rồi rã đông.

B.1.3. Dung dịch kháng sinh

B.1.3.1. Thành phần

Xefoperazon                                                                 0,02 g

Vancomyxin                                                                  0,02 g

Trimetoprim lactat                                                          0,02 g

Amphoterixin B                                                             0,01 g

...

...

...

B.1.3.2. Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trong hỗn hợp của etanol và nước cất vô trùng với tỷ lệ 50/50.

B.1.4. Môi trường hoàn chỉnh

B.1.4.1. Thành phần

Môi trường cơ bản (B.1.1)                                             1 000 ml

Huyết ngựa đã khử fibrin phân giải vô trùng (B.1.2)        50 ml

Dung dịch kháng sinh (B.1.3)                                         5 ml

B.1.4.2. Chuẩn bị

Bổ sung huyết một cách vô trùng vào môi trường cơ bản ở nhiệt độ từ 47 °C đến 50 °C, tiếp theo đến dung dịch kháng sinh và trộn. Phân phối môi trường này một cách vô trùng vào các ống hoặc các bình có dung tích thích hợp (xem 9.1.2) để thu được các phần cần thiết cho phép thử. Nếu môi trường tăng sinh đã được chuẩn bị trước, thì môi trường này không được để quá 4 giờ ở nhiệt độ phòng, hoặc nếu bảo quản ở nơi tối với nhiệt độ 3 °C ± 2 °C thì không quá 7 ngày.

...

...

...

Tính năng của canh thang Bolton phải được kiểm tra theo các phương pháp và các tiêu chí trong ISO/TS 11133-2. Các ví dụ về các chủng kiểm chứng thích hợp là Campylobacter jejuni NCTC 11351 hoặc ATCC 33291 với các tiêu chí sau: > 10 khuẩn lạc trên thạch deoxycolat xefoperazon than cải biến (mCCD) sau khi ủ vi hiếu khí ở 41,5 °C trong 44 h ± 4 h.

B.2. Thạch deoxycolat xefoperazon than cải biến (mCCD)

B.2.1. Môi trường cơ bản

B.2.1.1. Thành phần

Cao thịt                                                                         10,0 g

Dịch thủy phân mô động vật bằng enzym                       10,0 g

Natri clorua                                                                   5,0 g

Than củi                                                                        4,0 g

Dịch thủy phân casein bằng enzym                                3,0 g

...

...

...

Sắt (II) sulfat                                                                 0,25 g

Natri pyruvat 0,25 g

Thạch                                                                           8,0 g đến 18,0 g1)

Nước                                                                            1 000 ml

B.2.1.2. Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần cơ bản hoặc môi trường cơ bản hoàn chỉnh khô trong nước, bằng cách đun đến sôi. Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH là 7,4 ± 0,2 ở 25 °C, nếu cần. Phân phối môi trường cơ bản vào bình cầu có dung tích thích hợp. Khử trùng 15 min trong nồi hấp áp lực (6.1) ở 121 °C.

B.2.2. Dung dịch kháng sinh

B.2.2.1. Thành phần

Xefoperazon                                                                 0,032 g

...

...

...

Nước                                                                            5 ml

B.2.2.2. Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trong nước. Lọc để khử trùng.

B.2.3. Môi trường hoàn chỉnh

B.2.3.1. Thành phần

Môi trường cơ bản (B.2.1)                                             1 000 ml

Dung dịch kháng sinh (B.2.3)                                         5 ml

B.2.3.2. Chuẩn bị

Cho dung dịch kháng sinh vào môi trường cơ bản, làm nguội đến 47 °C đến 50 °C sau đó khuấy cẩn thận. Rót khoảng 15 ml môi trường hoàn chỉnh vào các đĩa Petri vô trùng. Để cho đông đặc. Ngay trước khi sử dụng, làm khô cẩn thận các đĩa thạch, tốt nhất là mở nắp và để mặt thạch úp xuống phía dưới, để vào tủ sấy (6.2) trong 30 min hoặc cho đến khi bề mặt thạch khô. Nếu đã chuẩn bị trước thì các đĩa thạch chưa khô không để quá 4 h ở nhiệt độ phòng, hoặc nếu bảo quản ở nơi tối với nhiệt độ 3 °C ± 2 °C thì không quá 7 ngày.

...

...

...

Đối với việc xác định tính chọn lọc và hiệu quả, xem ISO/TS 11133-1. Đối với các tiêu chí thực hiện, xem Bảng B.5 của ISO/TS 11133-2 : 2003.

B.3. Thạch huyết Columbia

B.3.1. Môi trường cơ bản

B.3.1.1. Thành phần

Dịch thủy phân mô động vật bằng enzym                       23,0 g

Tinh bột                                                                        1,0 g

Natri clorua                                                                   5,0 g

Thạch                                                                           8,0 g đến 18,0 g1)

Nước                                                                            1 000 ml

...

...

...

Hòa tan các thành phần cơ bản hoặc môi trường cơ bản hoàn chỉnh khô trong nước, bằng cách đun nóng. Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH là 7,3 ± 0,2 ở 25 °C, nếu cần. Phân phối môi trường cơ bản vào bình cầu có dung tích thích hợp. Khử trùng 15 min trong nồi hấp áp lực (6.1) ở 121 °C.

B.3.2. Huyết cừu vô trùng đã khử fibrin

B.3.3. Môi trường hoàn chỉnh

B.3.3.1. Thành phần

Môi trường cơ bản (B.3.1)                                             1 000 ml

Huyết cừu vô trùng đã khử fibrin (B.3.2)                         50 ml

B.3.3.2. Chuẩn bị

Cho huyết một cách vô trùng vào môi trường cơ bản, làm nguội đến 47 °C đến 50 °C. Rót khoảng 15 ml môi trường hoàn chỉnh vào các đĩa Petri vô trùng. Để cho đông đặc. Ngay trước khi sử dụng, làm khô cẩn thận các đĩa thạch, tốt nhất là mở nắp và để mặt thạch úp xuống phía dưới, để 30 phút trong tủ sấy (6.2) hoặc cho đến khi bề mặt thạch khô. Nếu đã chuẩn bị trước thì các đĩa thạch chưa khô không để quá 4 h ở nhiệt độ phòng, hoặc nếu bảo quản ở nơi tối với nhiệt độ 3 °C ± 2 °C thì không quá 7 ngày.

B.4. Canh thang Brucella

...

...

...

Dịch thủy phân casein bằng enzym 10,0 g

Dịch thủy phân mô động vật bằng enzym 10,0 g

Glucoza                                                                        1,0 g

Cao men                                                                       2,0 g

Natri clorua                                                                   5,0 g

Natri hydrosulfit                                                             0,1 g

Nước                                                                            1 000 ml

B.4.2. Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần cơ bản hoặc môi trường cơ bản hoàn chỉnh khô trong nước, bằng cách đun nóng, nếu cần. Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH là 7,0 ± 0,2 ở 25 °C, nếu cần. Phân phối môi trường cơ bản này với các lượng 10 ml vào các ống nghiệm có dung tích thích hợp. Khử trùng 15 min trong nồi hấp áp lực (6.1) ở 121 °C.

...

...

...

B.5.1. Thành phần

N,N,N’,N’-Tetrametyl-1,4-phenylenediamin dihydro clorua             1,0 g

Nước                                                                                        1 000 ml

B.5.2. Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trên trong nước ngay trước khi sử dụng.

B.6. Thuốc thử phát hiện thủy phân hipurat

B.6.1. Dung dịch natri hipurat

B.6.1.1. Thành phần

Natri hipurat                                                                                          10 g

...

...

...

      natri clorua                                                                                      8,5 g

      dinatri hydrophosphat ngậm hai phân tử nước (Na₂HPO₄.2H₂O)         8,98 g

      natri dihydrophosphat ngậm một phân tử nước (NaH₂PO₄.H₂O)         2,71 g

Nước, vừa đủ                                                                                       1 000 ml

B.6.1.2. Chuẩn bị

Hòa tan natri hipurat trong dung dịch PBS. Lọc để khử trùng. Phân phối thuốc thử một cách vô trùng với các lượng 0,4 ml vào các ống nghiệm nhỏ có dung tích thích hợp (6.7). Bảo quản ở khoảng -20 °C.

B.6.2. Dung dịch ninhydrin, 3,5 % (khối lượng/thể tích)

B.6.2.1. Thành phần

Ninhydrin                                                                      1,75 g

...

...

...

Butanol                                                                         25 ml

B.6.2.2. Chuẩn bị

Hòa tan ninhydrin trong hỗn hợp axeton/butanol. Bảo quản dung dịch nơi tối trong tủ lạnh tối đa 1 tuần.

B.7. Thạch huyết Hinton Mueller

B.7.1. Môi trường cơ bản

B.7.1.1. Thành phần

Dịch thủy phân mô động vật bằng enzym                       6,0 g

Dịch thủy phân casein bằng enzym                                17,5 g

Tinh bột, có thể hòa tan                                                 1,5 g

...

...

...

Nước                                                                            1 000 ml

B.7.1.2. Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần cơ bản hoặc môi trường cơ bản hoàn chỉnh khô trong nước, bằng cách đun đến sôi. Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH là 7,3 ± 0,2 ở 25 °C, nếu cần. Phân phối môi trường cơ bản này vào các bình cầu có dung tích thích hợp. Khử trùng 15 min trong nồi hấp áp lực (6.1) ở 121 °C.

B.7.2. Huyết cừu vô trùng đã khử fibrin

B.7.3. Môi trường hoàn chỉnh

B.7.3.1. Thành phần

Môi trường cơ bản (B.7.1)                                             1 000 ml

Huyết cừu vô trùng đã khử fibrin (B.7.2)                         50 ml

B.7.3.2. Chuẩn bị

...

...

...

B.8. Đĩa indoxyl axetat

B.8.1. Thành phần

Indoxyl axetat                                                               0,1 g

Axeton                                                                          1 ml

B.8.2. Chuẩn bị

Hòa tan indoxyl axetat trong axeton. Thêm 25 ml đến 50 ml dung dịch này vào các đĩa giấy trống (đường kính đĩa từ 0,6 cm đến 1,2 cm). Sau khi để khô ở nhiệt độ phòng, bảo quản các đĩa này ở 4 °C trong ống nghiệm màu nâu hoặc trong chai có chứa silica gel.

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] BAYLIS, C.L. el al. Comparison of three enrichment media for the isolation of Camplylobacter spp. from foods. J. Appl. Microbiol. 2000, 89, pp. 884-891

...

...

...

[3] BOLTON, F.J. et al. A blood-free selective medium for the isolation of Campylobacter jejuni from faeces. J. Clin. Microbiol. 1984, 19, pp. 169-171

[4] BOLTON, F.J. et al. Detection of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli in foods by enrichment culture and polymerase chain reaction enzyme-linked immunosorbent assay. J. Food Prot. 2002, 65, pp. 760-767

[5] CORRY, J.E.L. et al. (eds), Handbook of culture media for food microbiology. Progress in Industrial Microbiology. Vol. 37. Elsevier, Amsterdam, 2003

[6] HUNT, J.M. et al, Campylobacter. In: Food and Drug Administration Bacteriological Analytical Manual, 8^th Edition, AOAC, Arlington Va, USA, 1998

[7] HUTCHINSON, D.N. and BOLTON, F.J. Improved blood-free selective medium for the isolation of Campylobacter jejuni from faecal specimen. J. Clin. Pathol. 1984, 37, pp. 956-957

[8] KARMALI, M.A. et al. Evaluation of a blood-free, charcoal-based, selective medium for the isolation of Campylobacter organisms from faeces. J. Clin. Microbiol. 1986, 23, pp. 456-459.

[9] SKIRROW, M.B. Campylobacter enteritis: a new disease. Brit. Med. J. 1977, 2, pp. 9-11

1) Tùy thuộc vào sức đông của thạch.

1) Tùy thuộc vào sức đông của thạch.

...

...

...