9.9. Các chủng kiểm chứng

Để kiểm tra tính năng của môi trường tăng sinh và môi trường nhận dạng, nhằm đảm bảo cho việc phát triển L. monocytogenes, cần cho dung dịch pha loãng mẫu chuẩn từ chủng L. monocytogenes mới phân lập và các chủng kiểm chứng âm tính (ví dụ: các Steptococcus dạng que) vào bình kiểm chứng đựng môi trường tăng sinh chọn lọc ban đầu (xem 9.2). Cho vào mỗi bình từ 10 tế bào đến 100 tế bào L. monocytogenes hoặc các chủng kiểm chứng âm tính.

Tiến hành với các bình kiểm chứng giống như đối với mẫu cấy xét nghiệm để chứng minh rằng thu được chủng kiểm tra dương tính.

10. Biểu thị kết quả

Theo diễn giải các kết quả, ghi lại sự có mặt hay không có mặt Listeria monocytogenes trong phần mẫu thử, theo khối lượng qui định bằng gam hay mililit mẫu thử.

CHÚ THÍCH 10: Nếu các loài Listeria khác được tách biệt rõ, thì cũng có thể được ghi trong báo cáo kết quả thử nghiệm, nếu các bên có liên quan nhất trí.

11. Độ chụm

11.1. Khái quát

Không thể biểu thị độ chụm của phương pháp định tính bằng cách sử dụng các thông số độ lặp lại và độ tái lập mà chỉ có thể được tính bằng phương pháp định lượng. Do đó các tính năng thực hiện đã được lựa chọn (xem [3]). Các đặc trưng này là: độ đúng (độ nhạy đối với mẫu dương tính, tính đặc hiệu đối với mẫu âm tính), xác suất lặp lại và xác suất tái lập (xem 11.2, 11.3 và 11.4).

...

...

...

CẢNH BÁO - Trong phương pháp thử này, việc phân lập đã được tiến hành trên thạch PALCAM và Oxford. Các dữ liệu về độ chụm đưa ra một số hướng dẫn chung cho người sử dụng tiêu chuẩn này về cách thực hiện phương pháp và các dữ liệu về độ chụm này có thể áp dụng cho tiêu chuẩn này khi môi trường thạch phân lập thứ hai không phải là PALCAM hoặc Oxford.

11.2. Độ đúng

11.2.1. Định nghĩa

Độ đúng là phần trăm mẫu thử được nhận dạng đúng.

Đối với các mẫu dương tính, độ đúng được gọi là độ nhạy và là phần trăm mẫu được nhận dạng đúng là dương tính. Đối với mục đích của phép tính này, thì phải thừa nhận rằng tất cả các mẫu dương tính giả định trong thực tế có chứa sinh vật này.

Đối với các mẫu âm tính, độ đúng được gọi là tính đặc thù và là phần trăm mẫu được nhận dạng đúng âm tính.

11.2.2. Giá trị tổng thể

Như một chỉ thị chung của tính đặc thù (Sp), giá trị sau đây có thể được sử dụng khi thử nghiệm các mẫu thực phẩm nói chung: Sp = 97,4 %.

Như một chỉ thị chung của độ nhạy (Se), giá trị sau đây có thể được sử dụng khi thử nghiệm các mẫu thực phẩm nói chung: Se = 85,2 %.

...

...

...

Các giá trị này có thể được diễn giải là trong 85,2 % các trường hợp mẫu chứa L. monocytogenes được công nhận là dương tính khi được phân tích bằng phương pháp mô tả trong tiêu chuẩn này.

11.3. Xác suất lặp lại (Accordance)

11.3.1. Định nghĩa

Xác suất lặp lại là phần trăm cơ hội tìm thấy kết quả tương tự (nghĩa là cả hai dương tính hoặc cả hai âm tính) từ hai phần mẫu thử giống hệt nhau được phân tích trong cùng một phòng thử nghiệm, trong các điều kiện lặp lại (nghĩa là do cùng một người thao tác, sử dụng cùng thiết bị và cùng thuốc thử trong một khoảng thời gian ngắn nhất có thể).

Do đó xác suất lặp lại là tương đương độ lặp lại đối với phương pháp định lượng.

Để tính xác suất lặp lại từ các kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm, thì khả năng mà hai mẫu cho cùng kết quả được tính cho lần lượt từng phòng thử nghiệm tham gia và khả năng này là giá trị được tính trung bình cho tất cả các phòng thử nghiệm.

11.3.2. Giá trị tổng thể

Là một chỉ thị chung của xác suất lặp lại (Ac), giá trị sau đây có thể được sử dụng khi thử nghiệm các mẫu thực phẩm nói chung: Ac = 88,7 %.

Đối với các mẫu chuẩn (sử dụng các viên nang chứa 23 CFU, do RIVM, Hà Lan sản xuất), đã thu được giá trị sau đây: Ac = 88,2 %.

...

...

...

11.4. Xác suất tái lập (Concordance)

11.4.1. Định nghĩa

Xác suất tái lập là phần trăm cơ hội tìm thấy kết quả tương tự đối với hai mẫu thử giống hệt nhau được phân tích trong hai phòng thử nghiệm khác nhau.

Do đó, xác suất tái lập là tương đương độ tái lập đối với phương pháp định lượng.

Để tính xác suất tái lập từ các kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm, mỗi quan sát trong mỗi phòng thử nghiệm tham gia được lấy lần lượt, kết cặp với các kết quả thu được đối với mẫu cụ thể của tất cả các phòng thử nghiệm khác. Xác suất tái lập là phần trăm của tất cả các cặp cho kết quả như nhau trên tất cả các cặp của dữ liệu.

11.4.2. Giá trị tổng thể

Là một chỉ thị chung của xác suất tái lập (Cc), giá trị sau đây có thể được sử dụng khi thử nghiệm các mẫu thực phẩm nói chung: Cc = 84,4 %.

Đối với các mẫu chuẩn (sử dụng các viên nang chứa 23 CFU, do RIVM, Hà Lan sản xuất), đã thu được giá trị sau đây: Cc = 80,8 %.

Các giá trị này có thể được diễn giải rằng, nếu hai phần mẫu thử giống hệt nhau có chứa L. monocytogenes do hai phòng thử nghiệm thực hiện có 84,4 % cơ hội thu được kết quả tương tự (có mặt L. monocytogenes) đối với hai phần mẫu thử.

...

...

...

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ phương pháp đã sử dụng, nhiệt độ ủ và kết quả thu được. Bảo cáo kết quả thử nghiệm cũng cần phải đề cập đến tất cả các chi tiết thao tác không qui định trong tiêu chuẩn này, hoặc được xem là tùy ý, cùng với mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả.

Báo cáo thử nghiệm cũng bao gồm các thông tin cần thiết về việc nhận biết đầy đủ mẫu thử.

PHỤ LỤC A

(qui định)

SƠ ĐỒ QUI TRÌNH

PHỤ LỤC B

...

...

...

THÀNH PHẦN VÀ CÁCH CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG VÀ THUỐC THỬ

B.1. Môi trường tăng sinh chọn lọc ban đầu: Canh thang nửa Fraser

B.1.1. Môi trường cơ bản

B.1.1.1. Thành phần

Pepton thịt (thủy phân pepsin của mô động vật)

5,0 g

Trypton (thủy phân peptic từ casein)

5,0 g

Cao thịt bò

...

...

...

Cao men

5,0 g

Natri clorua

20,0 g

Dinatri hydro phosphat ngậm hai phân tử nước

12,0 g

Kali dihydro phosphat

1,35 g

Aesculin

...

...

...

Nước

1 000 ml

B.1.1.2. Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần cơ bản hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước bằng cách đun nóng, nếu cần.

Chỉnh pH, sao cho sau khi khử trùng là 7,2 ± 0,24) ở 25 °C, nếu cần.

Phân phối môi trường vào các bình cầu (6.7) có dung tích thích hợp để thu được các lượng cần thiết cho phép thử (xem 9.1).

Khử trùng 15 phút trong nồi hấp áp lực (6.1) ở nhiệt độ 121 °C.

CHÚ THÍCH 11: Có thể bổ sung dung dịch liti clorua (B.1.2) hoặc dung dịch axit nalidixic (B.1.3) vào môi trường cơ bản (B.1.1) trước khi hấp áp lực.

B.1.2. Dung dịch liti clorua

...

...

...

Liti clorua

3g

Nước

10 ml

B.1.2.2. Chuẩn bị

Cho liti clorua vào nước.

Khử trùng bằng cách lọc.

CẢNH BÁO - Cần phòng ngừa khi hòa tan liti clorua trong nước vì phản ứng tỏa nhiệt mạnh. Dung dịch này cũng kích thích màng nhầy.

B.1.3. Dung dịch muối natri của axit nalidixic

...

...

...

Muối natri của axit nalidixic

0,1 g

Natri hydroxit, dung dịch 0,05 mol/l

10 ml

B.1.3.2. Chuẩn bị

Hòa tan muối natri của axit nalidixic trong natri hydroxit.

Lọc để khử trùng.

B.1.4. Dung dịch acriflavin hydroclorua

B.1.4.1. Thành phần

...

...

...

0,25 g

Nước

100 ml

B.1.4.2. Chuẩn bị

Hòa tan acriflavin hydroclorua trong nước.

Lọc để khử trùng.

B.1.5. Dung dịch sắt (III) amoni xitrat

B.1.5.1. Thành phần

Sắt (III) amoni xitrat

...

...

...

Nước

100 ml

B.1.5.2. Chuẩn bị

Hòa tan sắt (III) amoni xitrat trong nước.

Lọc để khử trùng.

B.1.6. Môi trường hoàn chỉnh

B.1.6.1. Thành phần

Môi trường cơ bản (B.1.1)

100 ml

...

...

...

1,0 ml

Muối natri của axit nalidixic (B.1.3)

0,1 ml

Acriflavin hydroclorua (B.1.4)

0,5 ml

Sắt (III) amoni xitrat (B.1.5)

1,0 ml

B.1.6.2. Chuẩn bị

Trước khi sử dụng, cho bốn dung dịch (B.1.2 đến B.1.5) vào từng phần 100 ml môi trường cơ bản (B.1.1).

...

...

...

B.2.1. Môi trường cơ bản

B.2.1.1 Thành phần

Pepton thịt (thủy phân peptic của mô động vật)

5,0 g

Trypton (thủy phân peptic từ casein)

5,0 g

Cao thịt

5,0 g

Cao men

...

...

...

Natri clorua

20,0 g

Dinatri hydro phosphat ngậm hai phân tử nước

12,0 g

Kali dihydro phosphat

1,35 g

Aesculin

1,0 g

Liti clorua

...

...

...

Muối natri của axit nalidixic

0,02 g

Nước

1 000 ml

B.2.1.2. Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước bằng cách đun nóng, nếu cần.

Chỉnh pH, sao cho sau khi khử trùng là 7,2 ± 0,2 ở 25 °C, nếu cần.

Chuyển môi trường vào ống nghiệm có dung tích thích hợp để thu được lượng cần thiết cho phép thử.

Khử trùng 15 phút trong nồi hấp áp lực ở nhiệt độ 121 °C.

...

...

...

Xem B.1.4.

B.2.3. Dung dịch sắt (III) amoni xitrat

Xem B.1.5.

B.2.4. Môi trường hoàn chỉnh

Trước khi sử dụng, cho các phần 0,1 ml của các dung dịch B.2.2 và B.2.3 vào mỗi ống nghiệm đựng (các lượng 10 ml) môi trường cơ bản (B.2.1). Trộn nhẹ.

B.3. Thạch Listeria theo Ottaviani và Agosti (ALOA5))

B.3.1. Môi trường cơ bản

B.3.1.1. Thành phần

Dịch thủy phân mô động vật bằng enzym

...

...

...

Dịch thủy phân casein bằng enzym

6g

Cao men

10 g

Natri pyruvat

2g

Glucoza

2g

Magie glyxerolphosphat

...

...

...

Magie sulfat (khan)

0,5 g

Natri clorua

5g

Liti clorua

10 g

Dinatri hydro phosphat (khan)

2,5 g

5-bromo-4-cloro-3-indolyl-b-D-glucopyranosit

...

...

...

Thạch

12 g đến 18 g ^a

Nước

930 ml ^b

^a Tùy thuộc vào sức đông của thạch.

^b 925 ml nếu sử dụng dung dịch amphoterixin B (xem B.3.5.2).

B.3.1.2. Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần khô hoặc môi trường cơ bản hoàn chỉnh khô trong nước bằng cách đun sôi.

Khử trùng 15 phút trong nồi hấp áp lực ở nhiệt độ 121 °C.

...

...

...

B.3.2. Dung dịch muối natri của axit nalidixic

Muối natri của axit nalidixic

0,02 g

Natri hydroxit (dung dịch 0,05 mol/l)

5 ml

Hòa tan muối natri của axit nalidixic trong 5 ml natri hydroxit và lọc để khử trùng.

B.3.3. Dung dịch xeftazidim

Xeftazidim

0,02 g

...

...

...

5 ml

Hòa tan xeflazidim trong 5 ml nước và lọc qua màng 0,45 mm để khử trùng.

B.3.4. Dung dịch polymyxin B

Polymyxin B sulfat

76 700 IU

Nước

5 ml

Hòa tan polymyxin B trong 5 ml nước và lọc qua màng 0,45 mm để khử trùng.

B.3.5. Kháng sinh bổ sung

...

...

...

Xycloheximit

0,05 g

Etanol

2,5 ml

Nước

2,5 ml

Hòa tan xycloheximit trong 2,5 ml etanol và sau đó thêm 2,5 ml nước. Lọc qua màng 0,45 mm để khử trùng.

B.3.5.2. Dung dịch amphoterixin B (làm dung dịch thay thế cho xycloheximit)

Amphoterixin B

...

...

...

HCI (1 mol/l)

2,5 ml

Dimetylformamit (DMF)

7,5 ml

Hòa tan amphoterixin trong dung dịch HCI/DMF. Lọc qua màng 0,45 mm để khử trùng.

CẢNH BÁO - Dung dịch HCI/DMF rất độc, cần thận trọng khi sử dụng.

B.3.6. Dung dịch bổ sung

Hòa tan 2 g L-a-phosphatidylinositol (Sigma P 6636 ^®6)) trong 50 ml nước lạnh.

Khuấy khoảng 30 phút cho đến khi thu được dung dịch đồng nhất.

...

...

...

B.3.7. Môi trường hoàn chỉnh

B.3.7.1. Thành phần

Môi trường cơ bản (B.3.1)

930 ml ^a

Dung dịch axit nalidixic (B.3.2)

5 ml

Dung dịch xeftazidim (B.3.3)

5 ml

Dung dịch polymyxin B (B.3.4)

...

...

...

Dung dịch xycloheximit (B.3.5.1)

5 ml

hoặc dung dịch amphoterixin B (B.3.5.2)

10 ml

Dung dịch bổ sung (B.3.6)

50 ml

^a 925 ml nếu sử dụng dung dịch amphoterixin B.

B.3.7.2. Chuẩn bị

Cho các dung dịch trên vào môi trường cơ bản tan chảy ở khoảng 50 °C, trộn kỹ sau môi lần thêm.

...

...

...

Môi trường hoàn chỉnh phải mờ đục đồng đều.

B.3.7.3. Chuẩn bị các đĩa thạch

Cho vào mỗi đĩa Petri từ 15 ml đến 20 ml môi trường hoàn chỉnh vừa mới chuẩn bị, rồi để cho đông đặc.

B.3.8. Kiểm tra tính năng về đảm bảo chất lượng môi trường nuôi cấy

Đối với việc xác định tính chọn lọc và hiệu quả, xem ISO/TS 11133-2. Bảng B.1 đưa ra các chi tiết về kiểm tra tính năng đối với thạch Listeria theo Ottaviani và Agosti.

Bảng B.1 - Kiểm tra tính năng của Thạch theo Ottaviani và Agosti

Chức năng

Ủ

Chủng kiểm chứng

...

...

...

Phương pháp kiểm chứng

Chuẩn cứ

Phản ứng đặc trưng

Hiệu quả

48 giờ ở 37°C

L. monocytogenes 4b

ATCC 13932^a và/hoặc^b

L. monocytogenes 1/2a

ATCC 19111 (hoặc các chủng tương đương khác trong bộ sưu tập vi sinh đã được công nhận)

...

...

...

định lượng

PR ≥ 0,5

khuẩn lạc màu xanh có quầng mờ đục

Tính đặc thù

48 giờ ở 37°C

L. innocua ATCC 33090 (hoăc các chủng tương đương khác trong bộ sưu tập vi sinh đã được công nhận)

định tính

...

...

...

Tính chọn lọc

48 giờ ở 37°C

E.coli ATCC 25922 hoặc 8739^a và/hoặc E.feacalis ATCC 29212 hoặc 19433 (hoặc các chủng tương đương khác trong bộ sưu tập vi sinh đã được công nhận)

định tính

ức chế toàn phần

^a Chủng được sử dụng bởi phòng thử nghiệm (là tối thiểu)

^b Cả hai chủng được sử dụng bởi nhà sản xuất ra môi trường.

...

...

...

Giữ tế bào huyết cừu ở 3 °C ± 2 °C trước khi sử dụng.

Trước khi sử dụng phải kiểm tra dấu hiệu phân giải huyết (bị đỏ) trong lớp huyết thanh phía trên.

Nếu không phân giải huyết, thì lấy 2 ml lớp tế bào đỏ phía dưới cho vào 98 ml dung dịch đệm PBS (B.12).

Nếu thấy xuất hiện phân giải huyết, thì hòa khoảng 4 ml lớp tế bào đỏ trong 10 ml dung dịch đệm PBS và trộn nhẹ, rồi ly tâm. Nếu thấy có lớp nổi phía trên màu đỏ chứng tỏ có sự phân giải huyết, thì không sử dụng nữa và loại bỏ huyền phù gốc này. Mặt khác, gạn lớp nổi phía trên và cho 2 ml huyền phù tế bào này vào 98 ml dung dịch đệm PBS.

Bảo quản huyền phù này đến 5 ngày ở 3 °C ± 2 °C. Nếu thấy xuất hiện phản giải huyết thì loại bỏ.

B.5. Môi trường nuôi cấy đặc: Thạch từ dịch chiết nấm men trypton đậu tương (TSYEA)

B.5.1. Thành phần

Canh thang trypton đậu tương¹⁾

Cao men

...

...

...

Nước

30 g

6g

9 g đến 18 g ²⁾

1 000 ml

¹⁾ Trypton

17,0 g

Pepton đậu tương

3,0 g

...

...

...

5,0 g

Dikali hydro phosphat

2,5 g

Glucoza

2,5 g

²⁾ Tùy thuộc vào sức đông của thạch.

B.5.2. Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước bằng cách đun sôi.

...

...

...

Phân phối môi trường này vào các ống nghiệm có dung tích thích hợp để có được các lượng cần thiết cho phép thử.

Khử trùng 15 phút trong nồi hấp áp lực (6.1) ở nhiệt độ 121 °C.

Để yên trong tư thế nghiêng.

Để chuẩn bị các đĩa thạch, phân phối vào các đĩa Petri vô trùng với các lượng môi trường thích hợp cho phép thử. Để yên cho đông đặc.

B.6. Môi trường nuôi cấy lỏng: Canh thang từ dịch chiết nấm men trypton đậu tương (TSYEB)

B.6.1. Thành phần

Canh thang trypton đậu tương ¹⁾

30 g

Cao men

...

...

...

Nước

1 000 ml

¹⁾ Xem B.5.1

B.6.2. Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước bằng cách đun sôi, nếu cần.

Chỉnh pH, sao cho sau khi khử trùng là 7,3 ± 0,2 ở 25 °C, nếu cần.

Phân phối môi trường này vào các ống nghiệm hoặc bình có dung tích thích hợp để có được các lượng cần thiết cho phép thử.

Khử trùng 15 phút trong nồi hấp áp lực (6.1) ở nhiệt độ 121 °C.

B.7. Thạch huyết cừu

...

...

...

B.7.1.1. Thành phần

Pepton thịt

15 g

Dịch thủy phân gan

2,5 g

Cao men

5 g

Natri clorua

5 g

...

...

...

9 g đến 18 g ¹⁾

Nước

1 000 ml

¹⁾ Tùy thuộc vào sức đông của thạch.

B.7.1.2. Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trong nước bằng cách đun sôi.

Chỉnh pH, sao cho sau khi khử trùng là 7,2 ± 0,2 ở 25 °C, nếu cần.

Phân phối môi trường này vào các bình có dung tích thích hợp để có được các lượng cần thiết cho phép thử.

Khử trùng 15 phút trong nồi hấp áp lực (6.1) ở nhiệt độ 121 °C.

...

...

...

B.7.3. Môi trường hoàn chỉnh

B.7.3.1. Thành phần

Môi trường cơ bản (B.7.1)

100 ml

Huyết cừu đã khử fibrin (B.7.2)

5 ml đến 7 ml

B.7.3.2. Chuẩn bị

Cho huyết cừu vào môi trường cơ bản đã làm nguội đến 47 °C. Trộn đều.

Phân phối môi trường này vào các đĩa Petri vô trùng với các lượng thích hợp cho phép thử. Để yên cho đông đặc.

...

...

...

B.8.1. Môi trường cơ bản

B.8.1.1. Thành phần

Pepton proteoza

10 g

Cao men

1 g

Natri clorua

5g

Bromocresol tía

...

...

...

Nước

1 000 ml

B.8.1.2. Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trong nước bằng cách đun nóng, nếu cần.

Chỉnh pH, sao cho sau khi khử trùng là 6,8 ± 0,2 ở 25 °C, nếu cần.

Phân phối môi trường này vào các ống nghiệm có dung tích thích hợp để có được các lượng cần thiết cho phép thử.

Khử trùng 15 phút trong nồi hấp áp lực ở nhiệt độ 121 °C.

B.8.2. Dung dịch hydrat cacbon

B.8.2.1. Thành phần

...

...

...

5g

Nước

100 ml

¹⁾ L-Ramnosa hoặc D-xylosa

B.8.2.2. Chuẩn bị

Hòa tan riêng rẽ từng hydrat cacbon vào 100 ml nước.

Lọc để khử trùng.

B.8.3. Môi trường hoàn chỉnh

...

...

...

B.9. Môi trường thạch di động

B.9.1. Thành phần

Pepton casein

20,0 g

Pepton thịt

6,1 g

Thạch

3,5 g

Nước

...

...

...

B.9.2. Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trong nước bằng cách đun sôi.

Chỉnh pH, sao cho sau khi khử trùng là 7,3 ± 0,2 ở 25 °C, nếu cần.

Phân phối môi trường này với các lượng 5 ml vào các ống nghiệm.

Khử trùng 15 phút trong nồi hấp áp lực ở nhiệt độ 121 °C.

B.10. Môi trường CAMP (Christie, Atkins, Munch-Paterson) và chủng xét nghiệm

Đối với phép thử này có thể sử dụng các đĩa thạch huyết cừu (B.7), nhưng tốt nhất là sử dụng các đĩa thạch hai lớp có lớp môi trường huyết cừu rất mỏng (xem B.10.3).

B.10.1. Môi trường cơ bản

Xem B.7.1.

...

...

...

Xem B.7.3.1.

B.10.3. Môi trường hoàn chỉnh

Phân phối môi trường cơ bản (B.10.1) vào các đĩa Petri vô trùng, với các lượng khoảng 10 ml cho mỗi đĩa và để yên cho đông đặc. Rót đều một lớp rất mỏng môi trường huyết cừu (B.10.2) với các lượng không lớn hơn 3 ml trên một đĩa.

Để yên cho đông đặc. Nếu cho môi trường huyết cừu vào các đĩa môi trường cơ bản đã chuẩn bị trước, thì có thể phải làm ấm các đĩa này 20 phút bằng cách đặt chúng vào tủ ấm để ở 37 °C trước khi rót lớp môi trường huyết cừu.

B.10.4. Các chủng phản ứng CAMP

Chủng phân giải huyết b của S.aureus (ví dụ: NCTC 1803 hoặc ATCC 25923) và chủng R.equi (ví dụ: NCTC 1621 hoặc ATCC 6939) cần phải qua phép thử CAMP. Không phải tất cả các chủng S.aureus đều thích hợp đối với phép thử CAMP.

Bảo quản các chất cấy gốc của S. aureus, R. equi, L. monocytogenes, L. innocua và L. ivanivii bằng cách nuôi cấy lên môi trường TSYEA (B.5.2), nuôi ấm ở 35 ^oC hoặc 37 °C từ 24 giờ đến 28 giờ, hoặc cho đến khi thấy mọc và bảo quản trong tủ lạnh 3 °C ± 2 °C. Cấy truyền ít nhất một lần trong một tháng.

B.11. Dung dịch hydro peroxit

Sử dung dung dịch 3 % (tính theo khối lượng).

...

...

...

B.12.1. Thành phần

Dinatri hydro phosphat ngậm hai phân tử nước (Na₂HPO₄.2H₂O)

8,98 g

Natri dihydro phosphat (NaH₂PO₄)

2,71 g

Natri clorua (NaCI)

8,5 g

Nước

1 000 ml

...

...

...

Hòa tan các thành phần trong nước.

Chỉnh pH, sao cho sau khi khử trùng là 7,2 ± 0,2 ở 25°C, nếu cần.

Khử trùng 15 phút trong nồi hấp áp lực ở nhiệt độ 121°C.

PHỤ LỤC C

(tham khảo)

PHÉP THỬ RỌI HENRY

Kiểm tra các đĩa, sử dụng nguồn ánh sáng trắng, đủ sáng để rọi tốt các đĩa, rọi vào đáy đĩa một gốc 45° (xem hình C.1). Khi được kiểm tra dưới ánh sáng truyền trệch góc này (rọi Henry) trực tiếp trên đĩa, thì các khuẩn lạc Listeria spp cho thấy có màu xanh nhạt và bề mặt nổi hạt.

...

...

...

PHỤ LỤC D

(tham khảo)

KẾT QUẢ THỬ LIÊN PHÒNG THỬ NGHIỆM

Một phép thử cộng tác quốc tế do Phòng thử nghiệm Khoa học Trung tâm của Bộ Nông nghiệp, Thủy sản và Thực phẩm Anh tổ chức năm 1998, trong phạm vi dự án Châu Âu SNT CT 962098 (xem [3), [4]). Trong phép thử này gồm có 19 phòng thử nghiệm của 14 nước Châu Âu và tiến hành thử trên phomat tươi, thịt xay, bột trứng và mẫu chuẩn. Các mẫu thực phẩm, mỗi loại được kiểm tra ở hai mức nhiễm bẩn khác nhau và mẫu kiểm chứng âm tính. Các mẫu này đều bị nhiễm cả L. monocytogenes và L. innocua (Xem bảng D.1), nghĩa là có độ nhạy thấp. Do thiếu các nguồn cần thiết của các phòng thử nghiệm để tham gia vào phép thử này, mà đã không thể sử dụng cả hai môi trường phân lập Oxford và PALCAM cho tất cả các phòng thử nghiệm: 11 phòng đã sử dụng môi trường PALCAM và 9 phòng đã sử dụng môi trường Oxford.

Bảng D.1 - Các mẫu nhiễm bẩn

Các vi sinh vật (trong 25 g)

Mẫu trắng

Nhiễm mức thấp

...

...

...

L. monocytogenes

-

5 đến 100

50 đến 100

L. innocua

50 đến 100

5 đến 100

50 đến 100

Hệ sinh vật bản địa

...

...

...

+

+

Các giá trị về đặc trưng tính năng thu được từ phép thử cộng tác này cho thấy đối với từng loại mẫu trong các bảng từ D.2 đến bảng D.5. Các dữ liệu thu được với thạch Oxford và PALCAM đã được gộp lại. Dữ liệu thu được từ một số phòng thử nghiệm đã được loại ra khỏi tính toán, chỉ với các lý do kỹ thuật nhận biết rõ (lệch khỏi qui trình).

Bảng D.2 - Kết quả phân tích dữ liệu thu được với các mẫu bột trứng khô

Mẫu

(mức nhiễm bẩn)

Bột trứng khô
(không nhiễm)

Bột trứng khô
(nhiễm ở mức thấp)

...

...

...

Năm thực hiện phép thử liên phòng thử nghiệm

1998

1998

1998

Số lượng phòng thử nghiệm trả lại kết quả

18

18

18

Số lượng mẫu trên một phòng thử nghiệm

...

...

...

5

5

Số lượng phòng thử nghiệm bị loại

1

1

1

Số lượng phòng thử nghiệm còn lại sau khi loại trừ

17

17

...

...

...

Số lượng mẫu được chấp nhận

85

85

85

Độ đúng (tính đặc hiệu), %

97,9

-

-

Độ đúng (độ nhạy), %

...

...

...

53,7

88,4

Xác suất lặp lại, %

96,6

58,7

86,5

Xác suất tái lập, %

95,8

49,8

...

...

...

Bảng D.3 - Kết quả phân tích dữ liệu thu được với các mẫu thịt xay

Mẫu
(mức nhiễm bẩn)

Thịt xay
(không nhiễm)

Thịt xay
(nhiễm ở mức thấp)

Thịt xay
(nhiễm ở mức cao)

Năm thực hiện phép thử liên phòng thử nghiệm

1998

1998

...

...

...

Số lượng phòng thử nghiệm trả lại kết quả

18

18

18

Số lượng mẫu trên một phòng thử nghiệm

5

5

5

Số lượng phòng thử nghiệm bị loại

...

...

...

2

2

Số lượng phòng thử nghiệm còn lại sau khi loại trừ

16

16

16

Số lượng mẫu được chấp nhận

80

80

...

...

...

Độ đúng (tính đặc hiệu), %

97,8

-

-

Độ đúng (độ nhạy), %

-

83,3

100,0

Xác suất lặp lại, %

...

...

...

81,3

100,0

Xác suất tái lập, %

95,6

71,7

100,0

Bảng D.4 - Kết quả phân tích dữ liệu thu được với các mẫu phomat tươi

Mẫu

...

...

...

Phomat tươi

(không nhiễm)

Phomat tươi

(nhiễm ở mức thấp)

Phomat tươi

(nhiễm ở mức cao)

Năm thực hiện phép thử liên phòng thử nghiệm

1998

1998

...

...

...

Số lượng phòng thử nghiệm trả lại kết quả

16

16

16

Số lượng mẫu trên một phòng thử nghiệm

5

5

5

Số lượng phòng thử nghiệm bị loại

...

...

...

1

1

Số lượng phòng thử nghiệm còn lại sau khi loại trừ

15

15

15

Số lượng mẫu được chấp nhận

75

75

...

...

...

Độ đúng (tính đặc hiệu), %

96,5

-

-

Độ đúng (độ nhạy), %

-

85,9

100,0

Xác suất lặp lại, %

...

...

...

84,0

100,0

Xác suất tái lập, %

93,1

75,2

100,0

Bảng D.5 - Kết quả phân tích dữ liệu thu được với các mẫu chuẩn

Mẫu

...

...

...

Mẫu chuẩn

(Các viên nang chứa 23 CFU)^a

Năm thực hiện phép thử liên phòng thử nghiệm

1998

Số lượng phòng thử nghiệm trả lại kết quả

18

Số lượng mẫu trên một phòng thử nghiệm

5

Số lượng phòng thử nghiệm bị loại

...

...

...

Số lượng phòng thử nghiệm còn lại sau khi loại trừ

17

Số lượng mẫu được chấp nhận

85

Độ đúng (tính đặc hiệu), %

-

Độ đúng (độ nhạy), %

89,5

Xác suất lặp lại, %

...

...

...

Xác suất tái lập, %

80,8

^a Do RIVM, Hà Lan chuẩn bị cho phép thử.

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] OTTAVIANI, F., OTTAVIANI, M., AGOSTI, M. Differential agar medium for Listeria monocytogenes. Quimper Froid Symposium Proceedings, P6 ADRIA Quimper, 16-18 June, 1997

[2] LECLERCQ, A. Colonial atypical morphology and low recoveries of Listeria monocytogenes strains on Oxford, PACAM, Rapid’L. mono and ALOA solid media. J.Microbiol. Methods, 57, 2004, pp. 251-258

[3] Report of the trial “Detection of Listeria monocytogenes according to EN ISO 11290-1:1997”, available from CSL, Sand Hutton, YO4 1LZ, York, UK, 1999

[4] SCOTTER, S., LANGTON, S., LOMBARAD, B.. LAHELLEC, C., SCHULTEN, S., NAGELKERKE, N., IN'T VELD, P., ROLLIER, P. and BOHNERT, M. validiation of ISO method 11290 - Part 1: Detection of Listeria monocytogenes in foods. International Journal of Food Microbiology, 64, 2001, pp. 259-306

...

...

...

[6] ISO/TS 11133-2, Microbiology of food and animal feeding stuffs - Guidelines on preparation and production of culture media - Part 2: Practical guidelines on performance testing of culture media.