Tóm tắt các bước tách chiết được nêu trong Bảng A.2.

A.6.9.2. Quy trình phản ứng miễn dịch ELISA

A.6.9.2.1. Khái quát

Bộ thử ELISA có thể thực hiện theo nhiều dạng khác nhau sử dụng bất kỳ số hàng nào trong các hàng 8 giếng. Nên theo cách nạp giếng ngẫu nhiên, nghĩa là các mẫu thử và mẫu kiểm chứng không phải khi nào cũng cần phải nạp vào một vị trí cố định để tránh các ảnh hưởng vị trí trên khay có thể xảy ra, nếu có.

Tất cả các phản ứng phải được chạy tối thiểu hai lần song song và tính giá trị hấp thụ trung bình. Mỗi lần chạy bao gồm: phép thử trắng, mẫu trắng và dung dịch chuẩn đối chứng dương.

Khi đã bắt đầu phân tích thì tất cả các bước phải được hoàn tất mà không bị gián đoạn.

Tóm tắt quy trình ELISA được đưa ra trong bảng A.3.

A.6.9.2.2. Ủ ấm

Dùng micropipet lấy 100 ml dung dịch mẫu pha loãng và dung dịch mẫu chuẩn cho vào các giếng thích hợp và tiến hành phép thử trắng. Sử dụng các tip riêng cho mỗi lần hút pipet để tránh nhiễm bẩn sang các lần tiếp theo. Bọc khay bằng giấy bóng kính hoặc giấy nhôm (A.5.4) để tránh nhiễm bẩn và bay hơi.

...

...

...

Ủ ấm khay vi đĩa ở 37 ^oC trong 1 giờ.

A.6.9.2.3. Rửa

Rửa 3 lần bằng 300 ml dung dịch đệm rửa (A.6.7) bằng cách dùng máy trộn (A.5.8).

Rửa thủ công: Đổ hết lượng chứa trong các giếng bằng cách lật úp xuống các chậu rửa hoặc thùng rác. Dùng chai rửa loại 500 ml chứa dung dịch rửa, làm đầy các giếng, để khoảng 60 giây, sau đó lại đổ hết như trên. Lặp lại các bước rửa đó ít nhất 3 lần. Loại bỏ dịch lỏng và bọt khí còn sót lại bằng cách lật úp xuống lớp giấy lau.

Để tránh các hàng giếng bị rơi khỏi giá đỡ, nên dùng băng dính dán lại.

Rửa tự đồng: Sau khi ủ, dùng máy rửa vi đĩa hút hết lượng chứa trong các giếng, sau đó đổ đầy các giếng bằng dung dịch đệm rửa làm việc. Lặp lại thao tác hút rửa giếng ít nhất 3 lần. Cuối cùng, dùng máy hút khô các giếng rồi vỗ các khay lật úp lên tập giấy lau để loại hết chất lỏng và bọt khí.

CHÚ THÍCH 1 Không được để các giếng khô hẳn, vì có thể ảnh hưởng đến việc phân tích.

CHÚ THÍCH 2 Rửa không kỹ sẽ làm sai lệch kết quả. Dù rửa thủ công hay rửa bằng máy, cũng phải chắc chắn rằng mỗi giếng đều được rửa như nhau với các thể tích bằng nhau.

A.6.9.2.4. Bổ sung dung dịch kháng thể cộng hợp

...

...

...

Trước khi ủ, lắc nhẹ các khay vi đĩa bằng cách dùng ngón tay trỏ và ngón cái cầm mép ngắn của khay và đưa nhẹ sang hai phía.

Ủ các khay vi đĩa ở nhiệt độ 37 ^oC trong 1 giờ.

A.6.9.2.5. Rửa

Sau giai đoạn ủ, lặp lại các bước rửa như mô tả ở trên (A.6.9.2.3)

A.6.9.2.6. Bổ sung cơ chất

Dùng micropipet lấy 100 ml cơ chất màu (A.4.2.6) cho vào mỗi giếng. Lắc nhẹ khay và ủ trong 10 phút ở nhiệt độ phòng.

Việc bổ sung cơ chất màu phải thực hiện liên tục, không gián đoạn. Duy trì trình tự và khoảng cách thời gian như nhau trong quá trình bổ sung dung dịch.

A.6.9.2.7. Bổ sung dung dịch hãm

Sau khi ủ, dùng pipet lấy 100 ml dung dịch hãm (A.4.2.7) cho vào mỗi giếng, việc bổ sung dung dịch hãm phải theo đúng trình tự như đối với thuốc thử màu. Lắc nhẹ khay trong 10 giây để ngừng sự hiện màu và phân bố đều dung dịch hãm.

...

...

...

A.6.9.2.8. Đọc độ hấp thụ

Dùng máy đọc vi đĩa, có gắn bộ lọc phù hợp để đọc ở bước sóng 450 nm, đo độ hấp thụ trong từng giếng. Việc đọc phải thực hiện trong 30 phút sau khi bổ sung dung dịch hãm.

Ghi lại kết quả thu được và tính giá trị hấp thụ trung bình hoặc dùng chương trình máy tính.

A.7. Sơ đồ

Bảng A.2 – Qui trình tách chiết

Quy trình

Mô tả

Cân 0,5 g

Cân mẫu phân tích, mẫu trắng, mẫu chuẩn đối chứng

...

...

...

Thêm dung dịch đệm tách chiết (A.4.2.1)

Trộn

Trộn phần mẫu thử với dung dịch đệm chiết cho đến đồng nhất, đối với bột chưa tách chất béo thì thời gian trên sẽ nhỏ hơn 5 phút, còn đối với bột tách chất béo, mẫu protein thì nhiều hơn 15 phút.

Ly tâm ở 5 000 x g

Ly tâm mẫu ở 5 000 x g trong 15 phút, ở 4 ^oC. Loại bỏ phần nổi phía trên và cho vào một ống sạch.

Độ pha loãng: 1:300 hoặc 1:10 tùy theo loại nguyên liệu được nghiên cứu

Pha loãng dung dịch mẫu thử tạo thành, phân tích trắng và các chuẩn đối chứng.

Bảng A.3 – Qui trình ELISA

Quy trình

...

...

...

Mô tả

Bổ sung

100 ml

Dùng pipet lấy các dung dịch pha loãng, dung dịch mẫu thử, mẫu trắng và chuẩn đối chứng cho vào các giếng phân tích thích hợp và trộn.

Ủ

Ủ trong 1 giờ ở 37 ^oC

Rửa

...

...

...

Bổ sung

100 ml

Phân phối chất kháng thể cộng hợp (A.4.2.4) vào từng giếng phân tích và trộn.

Ủ

Ủ trong 1 giờ ở 37 ^oC

Rửa

Rửa 3 lần bằng dung dịch đệm rửa (A.6.7)

...

...

...

100 ml

Phân phối cơ chất màu (A.4.2.6) vào từng giếng và trộn.

Ủ

Ủ 10 phút ở nhiệt độ phòng.

Bổ sung

100 ml

Phân phối dung dịch hãm (A.4.2.7) vào từng giếng và trộn.

Đo độ hấp thụ

...

...

...

Đo độ hấp thụ của từng giếng phân tích trong máy đọc đĩa ở 450 nm.

A.8. Đánh giá

Số liệu phải được ghi lại.

Dùng các giá trị chuẩn để xây dựng đường chuẩn. Các giá trị từ phân tích trắng phải được trừ khỏi tất cả các giá trị của các dung dịch mẫu thử pha loãng và chuẩn đối chứng. Trung bình của các giá trị đã chỉnh từ mỗi điểm chuẩn được thực hiện hai lần song song phải được dùng để xây dựng đường chuẩn. Giá trị trung bình thu được từ mỗi dung dịch mẫu thử được thực hiện hai lần song song được dùng để suy ra nồng độ từ đường đó.

 A.9. Tiêu chí chấp nhận/loại bỏ

Mỗi vận hành phải đáp ứng được các tiêu chí chấp nhận/loại bỏ trong quy trình để có giá trị như liệt kê trong Bảng A.4. Một vận hành gồm: phân tích trắng, mẫu đối chứng dương, mẫu đối chứng âm và mẫu chưa biết. Tất cả các dung dịch mẫu thử, dung dịch mẫu chuẩn và phân tích trắng phải được chạy hai lần song song. Nếu vận hành không đạt các tiêu chí chấp nhận thì phải lặp lại toàn bộ qui trình. Các dung dịch mẫu thử không đạt được các tiêu chí chấp nhận trong bất kỳ lần vận hành nào thì phải tiến hành lần hai.

Bảng A.4 – Tiêu chí chấp nhận hoặc loại bỏ kết quả

Phân tích trắng dung dịch đệm

A 450 nm < 0,30

...

...

...

A 450 nm < 0,30

2,5 % chuẩn đối chứng

A 450 nm ³ 0,8

Tất cả các chuẩn đối chứng dương, OD

CV (OD) của các bản sao £ 15 %

Dung dịch mẫu không biết

CV (OD) của các bản sao £ 20 %

A.10. Tình trạng

Phương pháp này đã được thử nghiệm trong một nghiên cứu liên phòng thử nghiệm trên mẫu chuẩn CRM 410 theo TCVN 6910 (ISO 5725) do Trung tâm Nghiên cứu Phối hợp của Ủy ban châu Âu tại Ispra, Italia thực hiện, xem [3].

...

...

...

- Không rây,

- Không nói rõ sử dụng của các thuốc thử,

- Không nói rõ việc chuẩn bị mẫu,

- Phương pháp chỉ áp dụng trên mẫu chuẩn chứa 0,1 %, 0,5 % và 2 % CRM 410,

- Các chuẩn đối chứng không được phân tích hai lần song song,

- Lượng mẫu không đủ để lặp lại phân tích và để áp dụng các tiêu chí chấp nhận/loại bỏ.

Các kết quả thử liên phòng thử nghiệm được liệt kê trong Bảng A.5

Bảng A.5 – Dữ liệu về độ chụm

Phầm trăm mẫu sinh vật biến đổi gen trong bột đậu tương

...

...

...

1 %

2 %

Năm thử liên phòng thử nghiệm

1999

1999

1999

Số lượng phòng thử nghiệm

37

37

...

...

...

Số phòng thử nghiệm còn lại sau khi trừ ngoại lệ

37

33

35

Số ngoại lệ (phòng thử nghiệm)

0

4

2

Số kết quả được chấp nhận

...

...

...

33

35

Giá trị trung bình , % sinh vật biến đổi gen

0,440

0,952

1,902

% của giá trị thực

88,1

95,2

...

...

...

Độ lệch chuẩn lặp lại s_r^a

0,062

0,092

0,146

Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại RSD_r % ^b

12,4

9,2

7,3

Giới hạn lặp lại r [r = 2,8 . s_r]^a

...

...

...

0,260

0,414

Độ lệch chuẩn tái lập s_R^a

0,083

0,123

0,186

Độ lệch chuẩn tương đối tái lập RSD_R, %^b

16,6

12,3

...

...

...

Giới hạn tái lập [R = 2,8 . s_R]^a

0,238

0,349

0,527

^a s_r, s_R, r, và R được biểu thị bằng đơn vị % sinh vật biến đổi gen.

^b RSD_r và RSD_R được biểu thị như phần trăm của giá trị thực.

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

ISO 5725 (all Parts), Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results.

...

...

...

[1] Codex Committee on Methods of Analysis and Sampling: In House method validation. In House validated methods and their role in methods of analysis for codex purposes. Codex Alimentarius Commission. (CX/MAS 98/8), 1998, Budapest, Hungary, 23-27 November 1998

[2] Horwitz W.: Protocol for the design, conduct and interpretation of method performance studies. Pure and Applied Chemistry, 1995, 67: 331-343.

[3] Lipp, M., Anklam, E., and Stave, J., 2000. Validation of an Immunoassay for Detection and Quantitation of a Genetically Modified Soybean in Food and Food Fractions Using Reference Materials: Interlaboratory Study. Journal of AOAC International. Vol 83, No.4, pp.919-927.

[4] GMO Food Ingredient Testing, Soya kit User’s Guide, (1999) Strategic Diagnostics Inc., Rev. 052099, Vers.1.8.