2. Tiêu chuẩn viện dẫn

TCVN 3890 – 2 : 2002 (ISO 3890 – 2 : 2000) Sữa và các sản phẩm sữa – xác định dư lượng hợp chất clo hữu cơ (thuốc trừ sâu) – Phần 2: Các phương pháp làm sạch dịch chiết thô và thử khẳng định.

TCVN 6910 – 1 : 2001 (ISO 5725 – 1 : 1994) Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo. Phần 1: Nguyên tắc và định nghĩa chung.

TCVN 6910 – 2 : 2001 (ISO 5725 – 2 : 1994) Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo. Phần 2: Phương pháp cơ bản xác định độ lặp lại và độ tái lập của phương pháp đo tiêu chuẩn.

3. Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này áp dụng thuật ngữ và định nghĩa sau:

3.1. Hàm lượng các hợp chất clo hữu cơ (contents of organochlorine compounds):

Phần khối lượng của các chất xác định được bằng các quy trình quy định trong tiêu chuẩn này.

Chú thích – Hàm lượng các hợp chất clo hữu cơ được biểu thị bằng miligam trên kilogam chất béo hoặc sản phẩm (đối với các sản phẩm có hàm lượng chất béo thấp).

...

...

...

Chú thích – Các phương pháp này dựa trên quy trình bốn giai đoạn; đôi khi hai giai đoạn được kết hợp toàn bộ hoặc từng phần.

4.1. Chiết

Dư lượng trong chất nền của mẫu được chiết bằng các dung môi thích hợp, sao cho thu được phần dư lượng tối đa của dịch chiết và lượng tối thiểu của các chất khác bị chiết đồng thời mà có thể gây nhiễu phép xác định.

4.2. Làm sạch

Loại bỏ các chất gây nhiễu ra khỏi dịch chiết để thu được dung dịch chứa phần dư lượng đã chiết được trong một dung môi thích hợp cho việc kiểm tra định lượng bằng phương pháp xác định đã chọn.

4.3. Xác định

Hàm lượng các hợp chất clo hữu cơ được xác định bằng phương pháp sắc ký khí lỏng có dò điện tử - E.C.D (electron-capture-detection).  

4.4. Thử khẳng định

Phải khẳng định dư lượng thuốc trừ sâu đã nhận dạng được, đặc biệt trong những trường hợp dư lượng thuốc trừ sâu vượt quá mức tối đa cho phép.

...

...

...

5. Yêu cầu đối với thuốc thử và vật liệu

5.1. Khái quát

Chỉ sử dụng các thuốc thử loại tinh khiết phân tích, trừ khi có quy định khác, và nước cất hoặc nước đã khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương. Chưng cất lại nước và các dung môi được sử dụng và kiểm tra độ tinh khiết của chúng (xem 5.2). Giới hạn tạp chất của mỗi loại thuốc thử sử dụng không được vượt quá giới hạn quy định trong 14.4. Tuy nhiên, tổng lượng tạp chất của tất cả các thuốc thử sử dụng trong phương pháp có thể lớn hơn giới hạn này. Làm sạch và định kỳ hoạt hóa các chất hấp thụ theo các yêu cầu của các phương pháp phân tích khác nhau. Kiểm tra độ tinh khiết của chúng (xem 5.2.5).

Chú ý không để nước, các dung môi, các chất hấp thụ v.v. bị nhiễm bẩn bởi các vật liệu bằng chất dẻo hoặc cao su.

Bảo quản tất cả các thuốc thử, chất hấp thụ… đã được làm sạch trong chai hoặc lọ thủy tinh có nắp thủy tinh hoặc nút polytetrafloroetylen (PTFE). Không để chúng ngoài không khí sau khi đã làm sạch. Trong nhiều trường hợp, các lá nhôm được rửa bằng axeton có khả năng bảo vệ thích hợp.

5.2. Kiểm tra độ tinh khiết của thuốc thử

5.2.1. Dung môi

Cô đặc các dung môi với hệ số tương ứng trong phương pháp được sử dụng. Kiểm tra độ tinh khiết bằng phương pháp sắc ký khí lỏng (GLC) (xem 6.2). Sắc ký đồ phải không hiển thị mọi tín hiệu nhiễu của chất tạp nhiễm có nồng độ vượt quá giới hạn xác định theo 14.4. Chiết hoặc cô đặc axetonitril, dimetylformamit (DMF) và metylen clorua đến một thể tích giống như đã sử dụng trong phương pháp này và kiểm tra các dung dịch cuối bằng sắc ký khí.  

5.2.2. Nước

...

...

...

Sắc ký đồ phải không hiển thị mọi tín hiệu nhiễu của các chất tạp nhiễm có nồng độ vượt quá giới hạn xác định theo 14.4.  

5.2.3. Muối vô cơ    

Dùng n-hexan hoặc dầu nhẹ để chiết các muối vô cơ (ví dụ muối natri clorua), sau khi đã làm sạch theo các yêu cầu của các phương pháp phân tích khác nhau, và tất cả các dung dịch lỏng được sử dụng. Cô đặc dịch chiết với hệ số tương ứng trong phương pháp sử dụng và thử nghiệm bằng sắc ký khí lỏng (GLC). Sắc ký đồ phải không được hiển thị mọi tín hiệu nhiễu của các tạp chất có nồng độ vượt quá giới hạn xác định trong 14.4.

5.2.4. Bông cotton, bông thủy tinh và bông thạch anh

Sử dụng bộ chiết Soxhlet để chiết các chất này bằng n-hexan và axeton cho đến khi chúng không còn chứa các chất gây nhiễu.

5.2.5. Chất hấp thụ

Rửa giải một lượng chất hấp phụ đúng bằng lượng được sử dụng trong phương pháp phân tích và thể tích hỗn hợp dung môi tương ứng. Cô đặc dịch rửa giải theo hướng dẫn của phương pháp phân tích và kiểm tra độ tinh khiết bằng phương pháp GLC (xem 6.2). Sắc ký đồ không được hiển thị mọi tín hiệu nhiễu của các tạp chất có nồng độ vượt quá giới hạn xác định trong 14.4. Thường xuyên kiểm tra hoạt độ của các chất tạp phụ.

5.2.6. Dung dịch tiêu chuẩn

Sử dụng các vật liệu có độ tinh khiết ít nhất là 95% để chuẩn bị các dung dịch tiêu chuẩn dùng cho phân tích dư lượng thuốc trừ sâu.

...

...

...

Chú thích – Sự thay đổi thể tích do bay hơi dung môi, ví dụ qua những khe hở giữa nắp và cổ bình, có thể là một nguyên nhân gây ra sai số.

Bảo quản các dung dịch tiêu chuẩn trong các lọ thủy tinh trong tủ lạnh và tránh sự nhiễm bẩn có thể xảy ra do các vật liệu bằng chất dẻo hoặc cao su. Không để các dung dịch tiêu chuẩn tiếp xúc với ánh sáng mặt trời hoặc tia cực tím trong thời gian dài. Có thể sử dụng phương pháp khối phổ và sắc ký khí – lỏng để kiểm tra các chất chuẩn dùng trong phân tích về độ nhiễm bẩn. Kinh nghiệm cho thấy rằng các sai sót trong quá trình chuẩn bị, xử lý và bảo quản các chất chuẩn và dung dịch tiêu chuẩn là những nguyên nhân chính gây ra sai số.

6. Yêu cầu đối với thiết bị, dụng cụ

6.1. Khái quát

Làm sạch kỹ tất cả các dụng cụ thủy tinh được dùng trong phép phân tích dư lượng. Có thể dùng dung dịch axit cromic hoặc axit sunphuric nóng để làm sạch. Nếu sử dụng các dung dịch này, cần rửa sạch các dụng cụ thủy tinh, sau đó tráng lại bằng nước cất và axeton trước khi sấy khô. Ngay trước khi dùng, phải tráng lại các dụng cụ thủy tinh này bằng các dung môi được sử dụng để phân tích.

Không sử dụng các loại nút bằng chất dẻo thông thường [ví dụ như nhựa polyvinyl clorua (PVC)] cho các bình chứa các chất chuẩn vì chúng có thể làm nhiễm bẩn chất chuẩn. Cần dùng nút bằng thủy tinh hoặc polytetrafloroetylen (PTFE). Tương tự, không dùng phễu chiết có nút hoặc van khóa bằng chất dẻo. Chai rửa phải làm hoàn toàn bằng thủy tinh. Thay thế các nút thông thường bằng các nút thủy tinh hoặc nút PTFE.

Hầu hết các phương pháp đều quy định các loại cột sắc ký riêng, chúng được chế tạo đặc biệt và có khóa bằng thủy tinh hoặc PTFE. Tại đỉnh các cột sắc ký này phải có các khớp nối bằng thủy tinh mài để nối với bình chứa dung môi hoặc bộ phận điều chỉnh áp lực. Đôi khi một khớp nối bằng thủy tinh mài ở phía dưới vòi cũng có thể có tác dụng trong việc ứng dụng sức hút khi dùng bình Buchner thích hợp.

Có thể sử dụng hai loại thiết bị cô dung môi. Loại thứ nhất là thiết bị cô quay Kuderna – Danish1)  (hoặc tương tự), (xem tài liệu tham khảo [1]), thiết bị này có thể có hoặc không có cột phân đoạn và được gia nhiệt trên một buồng hơi. Loại thứ hai là các loại thiết bị cô quay màng mỏng khác nhau (có bán sẵn trên thị trường), loại thiết bị này cần có nguồn chân không, tốt nhất là bơm chân không sử dụng nước, và có thể gia nhiệt đến nhiệt độ cao hơn 50⁰C. Cần kiểm tra định kỳ ảnh hưởng của các loại thiết bị cô dung môi về sự thất thoát các thuốc trừ sâu dễ bay hơi. Có thể sử dụng “tác nhân bảo vệ” (propilen glycol, n-undecan hoặc hexadecan) để giảm thiểu sự thất thoát thuốc trừ sâu.

Nếu sử dụng các thiết bị đồng hóa, phải thận trọng để đảm bảo rằng chúng hoàn toàn không bị nhiễm bẩn. Kiểm tra bộ phận làm ẩm đĩa đáy để phát hiện các khe hở xung quanh đĩa này. Các chất hàn kín có thể một nguồn gây nhiễm bẩn.

...

...

...

Có thể xử lý giấy lọc bằng dung môi.

Bồn hơi và nồi cách thủy cũng cần có giá đỡ tương thích với các thiết bị được sử dụng.

Đôi khi cần sử dụng cả máy ly tâm có khả năng xử lý khoảng vài trăm mililit nhũ tương với tần số quay từ 2000 vòng/phút đến 4000 vòng/phút.

6.2. Thiết bị sắc ký khí lỏng (GLC)

Sử dụng hệ thống sắc ký khí lỏng thích hợp, tốt nhất được trang bị kèm theo bộ gia nhiệt riêng cho bộ bơm, detectơ và lò cột. Nhìn chung, thiết bị bơm mẫu trực tiếp lên cột sắc ký khí lỏng (GLC) là thích hợp nhất. Mặc dù sự lựa chọn các bộ phận khác nhau trong hệ thống sắc ký khí lỏng GLC là tùy thuộc kinh nghiệm của người phân tích, nhưng cũng cần xem xét các khuyến nghị sau đây:

a) Các E.C.D (³H, ⁶³Ni) đã được chứng minh là phù hợp nhất để xác định các hợp chất clo hữu cơ. Điều chỉnh các detectơ theo chỉ dẫn của nhà sản xuất. Định kỳ kiểm tra sự lệch độ nhạy của detectơ bằng cách kiểm tra độ tuyến tính của đồ thị hiệu chuẩn dùng các dung dịch tiêu chuẩn của thuốc trừ sâu (xem 5.2.6). Không dùng các detectơ ³H nếu yêu cầu nhiệt độ trên 225⁰C.

b) Tốt nhất là dùng các cột silica nóng chảy hoặc thủy tinh có độ dài từ 1,5m đến 3m và đường kính trong từ 2 mm đến 6 mm.

s) Sử dụng các vật liệu phụ trợ thích hợp, có chất lượng tốt. (Các vật liệu phụ trợ thích hợp như Gaschrom Q, Chromosorb W – HP, Anachrom Q tương ứng 60/80, 80/100 và 100/120 mesh đã được ứng dụng có hiệu quả)¹⁾.

d) Rất nhiều pha tĩnh và các hỗn hợp pha tĩnh được sử dụng có hiệu quả phụ thuộc vào số lượng và cả chủng loại thuốc trừ sâu clo hữu cơ, ví dụ:

...

...

...

- metylsillicon:                                 DC - 11, DC - 200, OV - 1, QC - 101, SP - 2100, SE - 30

- metylphenylsillion:                         OV – 17, OV – 61, OV – 25, SP – 2250, SE - 52

- trifloropropylmetysillicon:              QF – 1, OV – 210, SP - 2401

- phenylxianopropylmetylsillicon:      OV – 225, XE – 60

Làm lắng một cách cẩn thận các pha tĩnh trên cột phụ, tỷ lệ phụ thuộc vào sự kết hợp của cột phụ/pha được chọn. Trong mọi trường hợp, ổn định các cột mới nhồi ít nhất 24 h ở nhiệt độ gần với nhiệt độ tương thích tối đa của loại pha tĩnh được sử dụng. Kiểm tra hiệu quả và tính chọn lọc của chúng tại nhiệt độ hoạt động yêu cầu sử dụng hỗn hợp tiêu chuẩn của các hợp chất clo hữu cơ.

Sắc ký khí mao dẫn là một kỹ thuật quan trọng có khả năng chiết tốt hơn so với các cột nhồi. Kỹ thuật mao dẫn được khuyến nghị sử dụng đặc biệt trong trường hợp các chất chiết phức tạp. Tuy nhiên, hết sức chú ý khi sử dụng các ống mao dẫn thủy tinh đã khử hoạt tính, nếu không, ở mức nồng độ picogam, các hợp chất quan tâm sẽ bị thất thoát do bị hấp phụ lên bề mặt thủy tinh. Để tránh hiện tượng này, loại cột silica nóng chảy được khuyến nghị sử dụng.

Sử dụng nitơ khô, tinh khiết (không chứa oxy, khi sử dụng E.C.D), hoặc hỗn hợp khí argon/metan (khi dùng E.C.D dạng xung) làm khí mang cho các cột nhồi, với tốc độ dòng khí phụ thuộc vào kích cỡ và loại cột sử dụng. Kiểm soát tốc độ dòng khí theo các đặc tính của cột và detectơ. Nhìn chung, phải đảm bảo tốc độ dòng khí được kiểm soát càng chính xác càng tốt [±(0,5 đến 1,0)% giá trị của tốc độ dòng khí]. Đặt các bộ lọc rây phân tử trong các mạch nguồn và định kỳ phục hồi chúng. Nói tóm lại, cần đảm bảo các điều kiện của sắc ký khí lỏng (GLC) (nghĩa là chiều dài cột, loại pha tĩnh, bộ bơm, detectơ, nhiệt độ cột và tốc độ dòng khí .v.v…) sao cho việc tách các hợp chất clo hữu cơ càng gần với lượng thực có mặt càng tốt.

7. Lấy mẫu

Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. Nên lấy mẫu theo phương pháp trong TCVN 6400 : 1998 (ISO 707) [3].

...

...

...

8. Chuẩn bị mẫu thử

8.1. Sữa  

Điều chỉnh nhiệt độ của mẫu thử về 35⁰C đến 40⁰C, bằng cách sử dụng nồi cách thủy, nếu cần. trộn kỹ mẫu thử một cách nhẹ nhàng bằng cách lật đi lật lại hộp chứa mẫu mà không tạo bọt hoặc đánh kem và làm nguội nhanh đến nhiệt độ khoảng 20⁰C.

8.2. Sữa bột

Lắc và đảo chiều hộp chứa. Mở nắp hộp, rót từ từ mẫu thử sang hộp chứa thứ hai (có nắp đậy kín khí) và trộn đều bằng cách chuyển qua chuyển lại mẫu thử, chú ý không để chất béo hay bất kỳ thành phần nào khác của mẫu sót lại trên thành và đáy của hộp thứ nhất. Cuối cùng, chuyển hết mẫu sang hộp chứa thứ hai.

Trường hợp mẫu thử đựng trong các hộp kín, thì đặt các hôp chưa mở này trong nồi cách thủy ở nhiệt độ khoảng từ 40⁰C đến 60⁰C, nếu cần. Cứ 15 phút, lấy hộp ra và lắc mạnh. Sau 2 giờ, lấy hẳn hộp ra và để nguội đến nhiệt độ phòng. Mở hẳn nắp hộp, dùng thìa hoặc dao trộn để trộn kỹ lượng sữa trong hộp.

8.3. Sữa đặc có đường

Mở nắp hộp chứa và trộn kỹ lượng sữa bên trong bằng thìa hoặc dao trộn. Sử dụng các động tác vừa tạo chuyển động quay vừa tạo chuyển động lên - xuống sao cho các lớp trên cùng các phần ở góc và đáy hộp được trộn lẫn với nhau. Không để chất béo hoặc bất kỳ thành phần nào khác của mẫu sót lại trên thành và đáy của hộp. Chuyển hết mẫu thử sang hộp chứa thứ hai (có nắp đậy kín khí). Đậy nắp hộp.

Trường hợp mẫu thử được đựng trong các hộp kín, đặt các hộp chưa mở này trong nồi cách thủy ở nhiệt độ khoảng từ 30⁰C đến 40⁰C, nếu cần. Mở nắp hộp, chuyển toàn bộ lượng sữa bên trong ra đĩa có kích thước đủ rộng để có thể trộn được kỹ rồi tiến hành trộn cho đến khi toàn bộ lượng sữa đồng nhất.

...

...

...

8.4. Sản phẩm sữa bột

Trộn kỹ mẫu thử bằng cách quay và đảo ngược vật chứa mẫu nhiều lần. Chuyển toàn bộ mẫu thử vào một vật chứa kín khí có dung lượng đủ lớn, nếu cần.

8.5. Bơ và butterfat

Gia nhiệt mẫu thử đến nhiệt độ khoảg 60⁰C cho đến khi chất béo tách ra. Gạn mẫu qua nút bông thủy tinh vào phễu thủy tinh đã được gia nhiệt.

8.6. Phomat

Tách chất béo ra khỏi mẫu thử theo quy định trong TCVN 7082 – 2: 2002 (ISO 3890 - 2)

8.7. Các sản phẩm sữa khác

Đảm bảo rằng mẫu thử được đồng nhất.

9. Cách tiến hành

...

...

...

Những người thực hiện phải tự làm quen kỹ với phương pháp phân tích trước khi bắt đầu phép phân tích qui định. Cho chạy các thử mẫu trắng thuốc thử cho đến khi chúng thỏa mãn các yêu cầu của phép phân tích.

Đồng thời tiến hành các thử nghiệm phục hồi “sự mất hoạt tính” tại các mức phù hợp cho đến khi chúng thỏa mãn các yêu cầu của phép phân tích (xem điều 13). Tuân thủ một cách chính xác theo cùng một trình tự tiến hành cho mỗi phép phân tích và không có bất cứ một sự thay đổi nào.

Nếu không thể hoàn thành các phép phân tích trong vòng một ngày và cần dừng chúng vào ban đêm, thì phải bảo quản dịch chiết mẫu ở dạng dung dịch trong dung môi khan đựng trong bình có nắp đậy kín, đặt trong tủ lạnh ở nhiệt độ từ 0⁰C đến 5⁰C. Không được dừng quá trình chiết, sắc ký cột v.v…

Chú thích – Cần phải liên tục xem xét áp dụng các phương pháp khác, các kỹ thuật cập nhật hơn hay các kỹ thuật mới cho cùng một kết quả hoặc thậm chí cho kết quả chính xác hơn.

9.2. Chiết

Cân một lượng mẫu thử quy định, tốt nhất là tính bằng gam (±1%). Để các mẫu đông lạnh được rã đông trước khi ngâm vì trong một số trường hợp mẫu đông lạnh có thể gây khó khăn cho quá trình chiết. Thời gian ngâm mẫu ít nhất là 2 phút.

9.3. Làm sạch

Tiến hành quá trình tách trong phễu chiết mỗi lần ít nhất là 2 phút, lắc mạnh phễu và thỉnh thoảng phải cân bằng áp suất bằng cách mở van khóa phễu chiết đã đảo ngược. Nếu lắc mạnh tạo ra thể nhũ tương bền thì tốt nhất là nên lắc nhẹ trong khoảng thời gian dài hơn. Có thể phá vỡ thể nhũ tương bằng cách thêm vào 1 ml đến 2 ml dung dịch natri clorua hoặc natri sunphat bão hòa, hoặc bằng cách làm ấm dưới vòi nước nóng, hay cho ly tâm (xem điều 6). Khi các lớp phân tách, lấp lớp phân cách đã bị nhũ hóa để chiết lại hoặc loại bỏ. Tốc độ rửa giải của các cột sắc ký thường được quy định cụ thể nhưng nhìn chung phải nằm trong khoảng 1 ml/min đến 5ml/min.

Tại giai đoạn này của quy trình nên bổ sung một lượng đã biết pentaclobenzen dễ bay hơi (hoặc 1,7 - dibromoheptan) và chất chuẩn nội bay hơi ít hơn (ví dụ như Mixex: 1,2,3,4 –tetracloronaphtalen hoặc izodrin). Sử dụng petaclorobenzen làm chất chỉ thị đối với lượng thuốc trừ sâu dễ bị thất thoát trong giai đoạn bay hơi bằng cách so sánh chiều cao (diện tích) pic của nó với chiều cao (diện tích) pic thu được khi sử dụng các chất chuẩn nội bay hơi ít hơn. Có thể sử dụng các chất chuẩn nội để nhận biết (thời gian lưu tương đối) và để định lượng.

...

...

...

10. Thử sơ bộ

Bơm vào sắc ký khí (xem 6.2) một thể tích thích hợp từ 1,0 đến 10, tùy thuộc vào hệ thống các dịch chiết đã làm sạch thu được theo phương pháp phân tích đã sử dụng. Sắc ký đồ thu được có thể hiển thị được cả bản chất và cả nồng độ gần đúng của các hợp chất có mặt trong dịch chiết.

11. Thử định lượng

Nếu phép thử sơ bộ cho thấy dư lượng đạt tới hoặc vượt quá mức cho phép, thì kiểm tra lại kết quả thu được bằng cách sử dụng thêm ít nhất một cột sắc ký khí lỏng của bộ phận khác. Nếu kết quả thu được của cột này giống như lần trước, thì kiểm tra ít nhất là hai dịch chiết mới của mẫu.

Đối với phép thử định lượng, chuẩn bị hai dung dịch tiêu chuẩn (xem 5.2.6) của các hợp chất clo hữu cơ đã nhận biết (xem điều 10) trong dung môi được sử dụng cho dịch chiết cuối cùng, thường là dầu nhẹ hoặc n-hexan. Nồng độ của chúng phải bao trùm dải nồng độ dự kiến có trong dịch chiết cuối cùng (xem điều 10). Sau đó bơm hai dung dịch tiêu chuẩn và dịch chiết cuối cùng với thể tích như nhau vào sắc ký khí (xem 6.2). Tiến hành bơm các phần dịch chiết mẫu thử đã làm sạch cả trước và sau khi bơm hai dung dịch tiêu chuẩn. Đo chiều cao hoặc diện tích pic.

Kết quả thu được từ hai lần bơm bất kỳ của cùng một dung dịch tiêu chuẩn không lệch nhau quá 5%. Việc sử dụng chất chuẩn nộ cũng có thể được dùng để định lượng (xem 9.3).

12. Thử khẳng định

Sử dụng các quy trình để thử khẳng định sự nhận dạng các hợp chất clo hữu cơ phát hiện được, đặc biệt trong những trường hợp hàm lượng của chúng vượt quá giới hạn dư lượng tối đa (MRL). Phương pháp mô tả trong TCVN 7082 – 2 (ISO 3890 - 2) cho phép nhận biết dư lượng thông qua thời gian lưu của các hợp chất clo hữu cơ trên các cột sắc ký khi lỏng (GLC). Sử dụng ít nhất hai cột sắc ký có độ phân cực khác nhau. Ngoài ra, các quy trình như sắc ký mao dẫn thủy tinh, sắc ký lớp mỏng, khối phổ, độ tinh khiết (p-value), sắc ký khí lỏng đối với quá trình oxy hóa và các sản phẩm chuyển hóa khác và các kỹ thuật tương tự cũng rất có giá trị. Xem TCVN 7082 – 2 (ISO 3890 - 2).

13. Đánh giá kết quả

...

...

...

Tính nồng độ của hợp chất clo hữu cơ trong mẫu thử từ tỷ lệ giữa các phần tương ứng trên sắc ký đồ của mẫu và chất chuẩn hoặc của dãy chất chuẩn. Biểu thị nồng độ này theo mẫu thử hoặc chất béo (xem 13.2.1) tùy theo quy trình, sản phẩm và số lượng mẫu thử. Độ thu hồi ít nhất là 80% nếu không kết quả sẽ phải hủy bỏ (xem điều 9).  

13.2. Trình bày và biểu thị kết quả

13.2.1. Thông thường, hàm lượng thuốc trừ sâu clo hữu cơ trong các sản phẩm sữa được biểu thị theo chất béo. Tuy nhiên, trong trường hợp các sản phẩm sữa có hàm lượng chất béo thấp, thì nên biểu thị theo mẫu thử sẽ tốt hơn vì hàm lượng chất béo trong các sản phẩm sữa ít chất béo dao động lớn, phụ thuộc vào phương pháp chiết chất béo được sử dụng (xem phụ lục A về chiết chất béo)

13.2.2. Nên xác định hàm lượng chất béo bằng phương pháp thích hợp (xem tài liệu tham khảo) và ghi lại kết quả cùng với hàm lượng thuốc trừ sâu clo hữu cơ. Tiếp theo, nêu rõ hàm lượng thuốc trừ sâu clo hữu cơ đã được biểu thị theo cách nào, ví dụ miligam trên kilogam theo chất béo hay theo mẫu.

Chú thích – Điểm ngưỡng 2% chất béo là giá trị thực tiễn có thể thỏa thuận được

13.2.3. Khi giá trị dư lượng không đạt được hay vượt quá mức cho phép, thì phải ghi lại giá trị thu được từ một phép xác định đơn lẻ.

13.2.4. Trong trường hợp có một hoặc nhiều giá trị dư lượng đạt được hay vượt quá mức cho phép, thì cần tiến hành như sau:

a) Nêu rõ nồng độ trung bình và dải nồng độ của từng hợp chất clo hữu cơ. Không hiệu chỉnh nồng độ trung bình về phần trăm độ thu hồi các hợp chất clo hữu cơ.

b) Nêu rõ phần trăm thu hồi trung bình và giới hạn xác định của từng hợp chất clo hữu cơ tương ứng.

...

...

...

d) Nêu chi tiết về độ tái lập thường nhận được ở nồng độ trung bình đo được trong mẫu được ngoại suy từ các dữ liệu đã cho trong 13.2.2.

14. Độ chụm

14.1. Đánh giá độ chụm

Đánh giá độ chụm của phương pháp phân tích theo các yêu cầu của TCVN 6910 – 1: 2001 (ISO 5725-1 : 1994) và TCVN 6910-2 : 2001 (ISO 5725-2 : 1994). Một vài tiêu chí chung, dựa trên kinh nghiệm, được đưa ra trong 14.2 và 14.3 như các chỉ dẫn cho các nhà phân tích. 

14.2. Độ lặp lại

Mỗi phòng thử nghiệm nên định kỳ xác định độ lặp lại của mình bằng cách phân tích các mẫu đã bị mất hoạt tính các hợp chất clo hữu cơ thích hợp, hoặc, tốt nhất là sử dụng các mẫu chứa dư lượng còn hoạt tính, ở nồng độ gần mức cho phép tối đa. Các mẫu này nên lấy từ cùng một sản phẩm và nên dùng để làm mẫu thông thường và không có bất cứ dấu hiệu nào về bản chất đặc biệt, nếu có thể.

Chênh lệch giữa giá trị lớn nhất và giá trị nhỏ nhất của ba kết quả thử phải nhỏ hơn các giá trị đưa ra trong bảng 2. Xác định các giá trị trung gian bằng cách nội suy từ đồ thị logarit – logarit.

Bảng 2. Độ lặp lại

Mức dư lượng
mg/kg

...

...

...

0,01

0,005

0,1

0,025

1

0,125

Chú thích – Trong thí dụ này 0,01 mg/kg gần với giới hạn xác định

14.3. Độ tái lập

Sử dụng bảng 3, các số liệu trong bảng dựa trên các kết quả thực nghiệm. Xác định các giá trị trung gian bằng cách nội suy từ đồ thị logarit – logarit.

...

...

...

Mức dư lượng
mg/kg

Chênh lệch
mg/kg

0,01

0,01

0,1

0,05

1

0,25

Chú thích – Trong thí dụ này 0,01 mg/kg gần với giới hạn xác định

...

...

...

Về lý thuyết, giới hạn xác định của sản phẩm có liên quan được xác định là nồng độ của hợp chất clo hữu cơ (tính theo gam trên kilogam) tương ứng với độ cao h của pic thấp nhất có thể đo được, trên sắc ký đồ của dịch chiết sản phẩm, được xác định bằng phương trình sau:

h = h_B1 + 2W_B1

trong đó:

h_B1 là giá trị trung bình bằng số của chiều cao pic của thử mẫu trắng phía trên đường nền thông thường tại thời gian lưu tương ứng;

W_B1 là giá trị bằng số của biên độ trung bình của các tín hiệu nền của thử mẫu trắng tại thời gian lưu tương ứng (W_B1 có thể được xác định bằng đồ thị theo độ rộng tín hiệu nền trung bình của thứ mẫu trắng).

Giới hạn xác định phụ thuộc vào độ tinh khiết, bản chất của chất nền và điều kiện sắc ký khí lỏng (đặc biệt là loại cột và nhiệt độ cột, khí mang và độ nhậy của detctor). Vì những điều kiện này không thể quy định một cách chính xác, nên giới hạn xác định phải được thiết lập cho từng quy trình và trong mỗi phòng thử nghiệm. Về nguyên tắc chung, giới hạn xác định của dư lượng thuốc trừ sâu nên nhỏ hơn 10% giới hạn dư lượng tối đa của nó. Tuy nhiên, nếu giới hạn dư lượng tối đa là 0,05 mg/kg hoặc nhỏ hơn, thì giới hạn xác định bằng 20% giá trị này là phù hợp, ngoại trừ trường hợp giới hạn dư lượng tối đa đã được quy định bằng hoặc gần mức xác định.

15. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải nêu rõ:

- tất cả các thông tin cần thiết để nhận biết hoàn toàn mẫu thử;

...

...

...

- phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

- mọi chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc được coi là tùy ý lựa chọn, cùng với tất cả các chi tiết bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả thử;

- sự hiệu chỉnh đã thực hiện, nếu giá trị thu được lớn hơn 2,5 mg trong thử mẫu trắng về phương pháp;

- kết quả thu được; và nếu kiểm tra độ lặp lại thì nêu kết quả cuối cùng thu được.

PHỤ LỤC A

(quy định)

CHIẾT CHẤT BÉO VÀ CÁC HỢP CHẤT CLO HỮU CƠ VÀ XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CHẤT BÉO 

...

...

...

Các hợp chất clo hữu cơ được liên kết với pha chất béo và thường được biểu thị bằng miligam trên kilogam chất béo, đối với sản phẩm chứa hàm lượng chất béo cao (lớn hơn 2%). Trong những trường hợp như vậy, không cần thiết phải xác định hàm lượng chất béo của mẫu nhưng cần xác định dư lượng clo hữu cơ trong một khối lượng đã biết của chất béo chiết được. Nếu hàm lượng chất béo của mẫu thấp (dưới 2%), thì ngoài việc ghi lại hàm lượng clo hữu cơ theo mẫu, cần xác định phần trăm chất béo có trong mẫu.

A.2. Xác định hàm lượng chất béo

Tiến hành xác định hàm lượng chất béo của các mẫu có hàm lượng chất béo thấp (nhỏ hơn 2%) theo tiêu chuẩn thích hợp với sản phẩm tương ứng (xem danh mục tài liệu tham khảo) hoặc theo phương pháp đã cho các kết quả tương đương.

Phương pháp dùng bộ chiết Soxhlet không phù hợp để xác định chất béo trong sữa bột. Có thể dùng phương pháp phân tích sử dụng thiết bị hấp thụ hồng ngoại đang được ứng dụng rộng rãi đối với sữa và các sản phẩm sữa để xác định chất béo trong mẫu có hàm lượng chất béo thấp.

A.3. Chiết chất béo và các hợp chất clo hữu cơ

Các phương pháp chiết bao gồm:

a) Chiết Soxhlet, áp dụng cho các sản phẩm sữa không ở dạng lỏng;

b) Chiết bằng cột, áp dụng cho tất cả các sản phẩm sữa;

c) Phương pháp chiết theo AOAC, áp dụng cho sữa và các sản phẩm dạng lỏng

...

...

...

A.4. Thuốc thử

Chỉ sử dụng các thuốc thử loại phân tích, trừ khi có quy định khác và sử dụng nước cất, hoặc nước khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương.

A.4.1. Xe lit 5452)

Trước khi sử dụng, đốt nóng đến 600⁰C trong 4 giờ. Bảo quản trong bình có nắp kín khí.

A.4.2. Natri sunphat, khan (Na₂SO₄).

Trước khi sử dụng, nung nóng đến 600⁰C trong 6 giờ và sau đó làm nguội trong bình hút ẩm.

A.4.3. Cát biển, đã được rửa bằng axit (ví dụ Merk No.7712)²⁾.

Trước khi sử dụng, đốt nóng đến 600⁰C trong 5 giờ sau đó làm nguội trong bình hút ẩm.

A.4.4. Dầu nhẹ, nhiệt độ sôi trong khoảng từ 40⁰C đến 60⁰C.

...

...

...

A.4.5. Metanol, (CH₃OH) hoặc etanol (CH₃CH₂OH)

A.4.6. Dietyl ete (C₂H₅OC₂H₅), không chứa peroxit.

Chưng cất lại trước khi sử dụng.

A.4.7. n-Hexan [CH₃(CH₂)₄CH₃]

Chưng cất lại trên các hạt natri hydroxit trước khi sử dụng.

A.4.8. Axeton (CH₃COCH₃)

Chưng cất lại trên các hạt thủy tinh trước khi sử dụng.

A.4.9. Natri oxalat (Na₂C₂O₄) kali oxalat (K₂C₂O₄).

A.5. Thiết bị, dụng cụ

...

...

...

A.5.1. Tủ sấy, có khả năng duy trì nhiệt độ trong khoảng 102⁰C± 2⁰C đến 250⁰C±25⁰C.

A.5.2. Máy ly tâm, loại chống nổ, được trang bị ống thủy tinh dung tích 200 ml đến 300 ml, và có khả năng quay với tần số 2000 vòng/phút đến 4000 vòng/phút.

A.5.3. Thiết bị chiết Soxhlet, bao gồm:

a) Bình đáy tròn, dung tích 500 ml.

b) Bình chiết, dung tích khoảng 200 ml;

c) Bộ sinh hàn ngược;

d) Nguồn nhiệt (ví dụ đèn măng sông đốt nóng).

A.5.4. Bể cát, dầu hoặc hơi nước, công suất 400 W.

A.5.5. Xylanh, chứa khí trơ khô, gắn với loại xy lanh có đường PTFE.

...

...

...

A.5.7. Cân, có độ chính xác đến 0,001 g trong dải đo từ 0,01 g đến 1000 g.

A.5.8. Bộ cô quay, có bình bay hơi dung tích 500 ml.

A.5.9. Thiết bị làm nhỏ thực phẩm có nguồn gốc động vật (ví dụ máy trộn, máy khuấy, hoặc máy xay hình cầu).

A.5.10. Cột chiết, bao gồm ống thủy tinh có đường kính trong 12 mm và chiều dài tổng cộng là 300 mm, có cấu trúc thoát mao dẫn và chiều dài phần đỉnh là 100 mm và đường kính trong 50 mm ± 1 mm.

A.5.11. Mặt kính đồng hồ, đường kính 100 mm.

A.5.12. Cối giã, có chày.

A.5.13. Giấy lọc có rãnh, đường kính khoảng 300 mm, đã được rửa bằng dung môi.

A.5.14. Bầu chiết (tùy chọn), được chiết sơ bộ bằng dung môi tinh khiết nhất và bảo quản trong hexan đựng trong bình thủy tinh.

Chú thích – Sử dụng bầu chiết thường dẫn đến sự có mặt các tạp chất trong dịch chiết mẫu (xuất hiện các pic nhiễu trong sắc ký khí đồ).

...

...

...

Trước khi sử dụng, chiết bằng hỗn hợp dung môi hexan/axeton và bảo quản trong bình chứa hexan.

A.5.16. Phễu thủy tinh, loại dài và ngắn

A.5.17. Phễu chiết

A.5.18. Bi thủy tinh và đũa thủy tinh, đã được rửa bằng dung môi.

A.5.19. Cốc, các cỡ khác nhau.

A.5.20. Bình định mức.

A.5.21. Dao và kẹp.

A.5.22. Bơm nước.

A.6. Quy trình chiết

...

...

...

Làm nóng bình đáy tròn dung tích 500 ml (A.5.3) chứa năm viên thủy tinh (A.5.18) trong tủ sấy (A.5.1) đến 102⁰C trong 30 phút. Làm nguội đến nhiệt độ phòng và cân. Lặp lại quá trình sấy cho đến khi khối lượng không đổi, nghĩa là cho đến khi chênh lệch giữa kết quả của hai lần cân liên tiếp không quá 0,01 g.

Cân trực tiếp mẫu trên một mặt kính đồng hồ (A.5.11). Đối với phomat thì cắt mẫu thành từng miếng nhỏ. Chuyển mẫu vào gối giã (A.5.12) và nghiền kỹ trong hỗn hợp cát (A.4.3) và natri sunphat (A.4.2) (tỷ lệ 1:1 theo khối lượng) để thu được một dạng bột khô. Cũng có thể sử dụng xelit 545 (A.4.1). Lượng natri sunphat (A.4.2) và cát (A.4.3) yêu cầu phụ thuộc vào số lượng và hàm lượng nước của thực phẩm. Chuyển lượng bột thu được sang giấy lọc (A.5.13).

Lau khô cối giã, chày và mặt kính đồng hồ bằng một miếng bông cotton (A.5.15) đã được tẩm dầu nhẹ (A.4.4). Đặt miếng bông cotton vào giấy lọc đã chứa bột (A.5.13) và chuyển toàn bộ chúng (đã được gói lại) vào trong bình chứa của thiết bị chiết Soxlhet.

Sau đó cho vào bình (A.5.3) đã cân, 250 ml dầu nhẹ (A.4.4) và lượng dịch chiết mẫu sau 6 giờ dưới dòng đối lưu. Cho dung môi vào bộ cô quay (A.5.8) ở nhiệt độ khoảng 50⁰C và trong điều kiện áp suất giảm sử dụng bơm nước (A.5.22) và cân bình. Lặp lại quy trình như trên cho đến khi thu được khối lượng bình không đổi, nghĩa là cho đến khi chênh lệch giữa kết quả của hai lần cân liên tiếp không quá 0,01 g.

A.6.2. Chiết bằng cột

Trộn kỹ một lượng mẫu thích hợp với một lượng vừa đủ cát (A.4.3) và natri sunphat (A.4.2) (tỷ lệ 1 : 1 theo khối lượng) trong một cối giã (A.5.12) hoặc một máy xay hình cầu (A.5.9) để thu được sản phẩm dạng khô. Đối với trường hợp chiết sữa bột, hoàn nguyên hoàn toàn chúng bằng nước cất (theo tỷ lệ 9 : 1) trước khi trộn. Chuyển hỗn hợp này vào cột chiết (A.5.10) mà trước đó đã được nhồi một lớp natri sunphat dầy 2cm và được đậy một nút nhỏ bằng bông thủy tinh (A.15.5). Rửa cột khô bằng hỗn hợp n-hexan (A.4.7) và axeton (A.4.8) (tỷ lệ 2 : 1 theo thể tích). Lượng dung môi phụ thuộc vào khối lượng và bản chất của mẫu. Thu các chất rửa giải được qua đêm và cô đặc chúng trong bộ cô quay (A.5.8) như đã mô tả trong A.6.1.

A.6.3. Phương pháp chiết theo AOAC

A.6.3.1. Lắc 100 ml sữa với 100 ml metanol (A.4.5) và 1 g natri oxalat (A.4.9) khoảng 1 phút trong phễu chiết dung tích 500 ml (A.5.17). Thêm 50 ml dietyl ete (A.4.6) và lắc thêm khoảng 1 phút. Lặp lại các thao tác trên với 50 ml dầu nhẹ (A.4.4).

A.6.3.2. Cách khác, lượng mẫu và thuốc thử đã nói ở trên có thể giảm đi một nửa, thêm 50 ml hỗn hợp diety ete/dầu nhẹ (tỷ lệ 1 : 1 theo thể tích). Trong trường hợp này, hỗn hợp cần được khuấy trộn mạnh trong 2 phút. Bước tiếp theo tiến hành theo cách tương tự.

...

...

...

A.6.4. Chiết bơ

Gia nhiệt mẫu đến khoảng 50⁰C và gạn qua bộ lọc nóng và khô. Hòa tan butterfat trong dung môi thích hợp.

PHỤ LỤC B

(tham khảo)

PHÉP PHÂN TÍCH KHI CÓ MẶT BIPHENYL ĐÃ POLYCLO HÓA (PCB)

B.1. Khái quát

Dư lượng biphenyl đã polyclo hóa (một hỗn hợp các đồng phân thu được khi clo hóa biphenyl) thường xuyên được tìm thấy trong thực phẩm, chủ yếu là thực phẩm có nguồn gốc từ động vật, cũng như trong một số vật liệu bao gói. Cho đến giai đoạn chiết và tách theo phương pháp đã đề cập, chúng thể hiện nhiều đặc điểm rất giống với các hợp chất trừ sâu clo hữu cơ. Trên sắc ký khí đồ, các pic của các hợp chất biphenyl đã polyclo hóa (PCB) có thể sẽ chồng lên trên các pic của một số hợp chất trừ sâu clo hữu cơ (đặc biệt là pic sắc ký của nhóm DDT) và điều này sẽ làm cho việc định lượng các loại thuốc trừ sâu đó khó hơn. Ví dụ, trong các trường hợp hàm lượng biphenyl đã polyclo hóa cao, 1 mg/kg biphenyl đã polyclo hóa có thể giống như 0,1 mg/kg dư lượng thuốc trừ sâu p,p – DDT. 

B.2. Tách PCB ra khỏi hợp chất trừ sâu clo hữu cơ bằng sắc ký cột hoặc bằng cách điều chế các dẫn xuất   

...

...

...

Các hợp chất PCB và aldrin thường được rửa giải đầu tiên ra khỏi cột silicagen bằng dầu nhẹ, tiếp đến các hợp chất trừ sâu clo hữu cơ được rửa giải bằng hỗn hợp các dung môi axetonitril/hexan/diclorometan (tỷ lệ 1 : 90 : 80 theo thể tích).

Trong các trường hợp khi có mặt của p,p – DDT gây khó khăn cho việc định lượng, thì có thể tách DDT bằng cách tạo các dẫn xuất rồi tách các sản phẩm chuyển hóa của nó. Crom trioxit (Cr₂O₃) trong axit axetic băng oxi hóa p,p – DDT thành p,p – diclorobenzophenon. Các hợp chất PCB còn lại về cơ bản không bị ảnh hưởng. Xử lý dịch chiết bằng dung dịch rượu kiềm tính trước khi thực hiện xự oxy hóa bằng axit anhydrit cromic có thể khẳng định p,p – DDT khi có mặt các hợp chất PCB. Trong quy trình này, đầu tiên p,p - DDT được cho phản ứng với kiềm để tạo thành p,p – DDE, sau đó hợp chất này tiếp tục bị oxi hóa thành p,p – diclorobenzophenon.

Sử dụng phương pháp sắc ký khí cột mao dẫn có thể không cần đến việc tách bằng cột sắc ký và có tác dụng tích cực đến sự định lượng hợp chất trừ sâu clo hữu cơ khi có mặt các hợp chất PCB.

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Gunther F.A et al. Anal. Chem., 23, 1951, p. 1835.

[2] Burke.j.A.,Mills P.A and Bostwisk D.C.J. AOAC, 49, 1966, p. 999.

[3] TCVN 6400 : 1998 (ISO 707) Sữa và sản phẩm sữa – Hướng dẫn lấy mẫu.

[4] TCVN 6508 : 1999 (ISO 1211) Sữa. Xác định hàm lượng chất béo. Phương pháp khối lượng (phương pháp chuẩn).

...

...

...

[6] ISO 1737 Evaporated mlk and sweetened condensed milk – Determination of fat content – Gravimetric method (Reference method).

[7] ISO 1854 Whey cheese – Determination of fat content – Gravimetric method (Reference method).

[8] ISO 2450 Cream – Determination of fat content – Gravimetric method (Reference method).

[9] TCVN 6833 : 2001 (ISO 7208) Sữa gầy, whey và buttermilk. Xác định hàm lượng chất béo. Phương pháp khối lượng (phương pháp chuẩn).

[10] TCVN 6687 : 2000 (ISO 8381) Thực phẩm từ sữa dùng cho trẻ em nhỏ. Xác định hàm lượng chất béo bằng phương pháp khối lượng của Rose – Gottlieb (phương pháp chuẩn).

[11] TCVN 6668 – 1 : 2000 (ISO 8262-1), sản phẩm sữa và thực phẩm từ sữa. Xác định hàm lượng chất béo bằng phương pháp khối lượng Weibull – berntrop (phương pháp chuẩn). Phần 1: Thực phẩm dành cho trẻ nhỏ.

[12] TCVN 6668 – 2: 2000 (ISO 8262 - 2), Sản phẩm sữa và thực phẩm từ sữa. Xác định hàm lượng chất béo bằng phương pháp khối lượng Weibull – berntrop (phương pháp chuẩn). Phần 2: Kem lạnh và kem lạnh hỗn hợp.

[13] TCVN 6668 – 3 : 2000 (ISO 8262 - 3), Sản phẩm sữa và thực phẩm từ sữa. Xác định hàm lượng chất béo bằng phương pháp khối lượng Weibull – berntrop (phương pháp chuẩn). Phần 3: Các trường hợp đặc biệt.

[14] IDF 130A, Milk and milk products – Determination of polychlorinated.