Hàm lượng axit L- hoặc D-lactic và lactat có thể xác định riêng rẽ bằng cách thêm L-LDH (4.8) hoặc D- LDH (4.9).

Khi cần đo axit L-lactic và lactat, thì độ hấp thụ có thể được xác định tương ứng sau 30 phút và 45 phút trộn.

8.2.2 Tính độ hấp thụ A cần để tính trong 9.1, bằng công thức :

trong đó

A_s60 là độ hấp thụ của dung dịch thử đo được trong 8.2.1 sau 60 phút;

A_s0 là độ hấp thụ của dung dịch thử đo được trong 8.2.1;

A_s45là độ hấp thụ của dung dịch thử đo được trong 8.2.1 sau 45 phút;

A_b60 là độ hấp thụ của dung dịch thử trắng đo được trong 8.2.1 sau 60 phút;

...

...

...

A_b45 là độ hấp thụ của dung dịch thử trắng đo được trong 8.2.1 sau 45 phút;

Đôi khi xảy ra phản ứng phụ từ từ. Ảnh hưởng của phản ứng phụ này lên độ hấp thụ có thể loại trừ bằng phép ngoại suy độ hấp thụ ở thời điểm bằng không.

Khi chỉ đo axit L-lactic và lactat (xem 8.2.1), thì độ hấp thụ có thể được đo sau 30 phút và 45 phút tương ứng. Khi đó công thức sẽ là:

trong đó

A_s60 là độ hấp thụ của dung dịch thử đo được trong 8.2.1 sau 30 phút;

A_b30 là độ hấp thụ của dung dịch thử trắng đo được trong 8.2.1 sau 30 phút;

8.2.3. Nếu độ hấp thụ tính được trong 8.2.2 tăng quá 0,500 đơn vị, thì lặp lại các qui trình qui định trong 8.2.1 đến hết 8.2.3, sử dụng độ pha loãng thích hợp của dịch lọc thu được từ phần mẫu thử (7.4.3) và cả dung dịch thử trắng (7.3).

9. Tính toán và biểu thị kết quả

...

...

...

Hàm lượng axit lactic và lactat, w_L, được biểu thị theo miligam axit lactic trên 100 g chất khô không chứa chất béo, theo công thức sau:

trong đó

A là độ hấp thụ ở bước sóng 340 nm, tính được trong 8.2.2;

Mr là khối lượng phân tử của axit lactic (Mr = 90,1);

k là hệ số hấp thụ phân tử của NADH ở 340 nm, tức là 6,3 x 10⁶ cm²/mol;

/ là chiều dài đường quang của cuvet quang phổ, tính bằng xentimet (/ = 1 cm);

m là khối lượng phần mẫu thử (7.3). tính bằng gam;

V₁ là tổng thể tích chất lỏng trong cuvet đo (xem 8.2.1), tính bằng mililit:

...

...

...

- khi chỉ phải xác định axit L-lactic và lactat, thì V₁ = 2,24 ml;

- khi chỉ phải xác định axit D-lactic và lactat, thì V₁  = 2,27 ml;

V₂ là thể tích dịch lọc (xem 7.4.3) trong cuvet đo của máy đo phổ (xem 8.2.1), tính bằng mililit;

V₃ là thể tích dịch lọc (xem 7.4.3) được dùng để pha loãng (xem 8.2.3), nếu cần, tính bằng mililit;

V₄ là thể tích của dung dịch trong 7.4.2 (V₄= 100 ml), tính bằng mililit;

V₅ là thể tích của dung dịch dùng để đã pha loãng mẫu thử (xem 8.2.3), nếu cần, tính bằng mililit;

w_s là hàm lượng chất khô không chứa chất béo của mẫu, được biểu thị theo phần trăm khối lượng.

CHÚ THÍCH Việc xác định hàm lượng chất béo không phải là một phần qui định trong tiêu chuẩn này. Phương pháp xác định hàm lượng chất béo qui định trong ISO 1736.

9.2. Biểu thị kết quả

...

...

...

10. Độ chụm

10.1. Phép thử liên phòng thử nghiệm

Các giá trị về độ lặp lại và độ tái lập thu được từ các kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm tiến hành theo TCVN 6910 (ISO 5725)2⁾.

Các chi tiết của phép thử liên phòng thử nghiệm về độ chụm đã được công bố (xem [5]). Các giá trị thu được từ phép thử liên phòng thử nghiệm này có thể không áp dụng được cho các dải nồng độ và chất nền khác với dải đã đưa ra.

10.2. Độ lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm riêng rẽ độc lập thu được, khi sử dụng cùng phương pháp thử trên vật liệu thử giống hệt nhau, do cùng một người phân tích sử dụng cùng một thiết bị, tiến hành trong cùng một phòng thử nghiệm, trong một khoảng thời gian ngắn, không quá 5 % các trường hợp lớn hơn:

a) giá trị trung bình cộng của hàm lượng axit lactic và lactat ≤ 60 mg/100 g chất khô không chứa chất béo: 10 mg/100 g;

b) giá trị trung bình cộng của hàm lượng axit lactic và lactat > 60 mg/100 g chất khô không chứa chất béo: 15 % (tương đối) trung bình cộng.

10.3. Độ tái lập

...

...

...

a) giá trị trung bình cộng của hàm lượng axit lactic và lactat ≤ 100 mg/100 g chất khô không chứa chất béo: 15 mg/100 g;

b) giá trị trung bình cộng của hàm lượng axit lactic và lactat > 100 mg/100 g chất khô không chứa chất béo: 20 % (tương đối) trung bình cộng.

11. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải chỉ ra:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

c) phương pháp thử đã sử dụng và viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) tất cả các chi tiết thao tác không qui định trong tiêu chuẩn này, cùng với các chi tiết bất thường nào khác có thể ảnh hưởng tới kết quả;

e) kết quả thử nghiệm thu được, hoặc nếu độ lặp tại được kiểm tra thì nêu kết quả cuối cùng thu được

...

...

...

Phụ lục A

(qui định)

Các qui tắc thực hành phòng thử nghiệm tốt (GLP) về thực hành phân tích bằng phương pháp enzym

A.1 Giới thiệu

Các qui tắc thực hành phòng thử nghiệm tốt về phân tích bằng phương pháp enzym là ít phổ biến hơn các phương pháp phân tích hoá học khác, cần chú ý hướng đến các qui tắc như vậy để thu được các kết quả có độ chụm và độ chính xác thoả đáng. Trước khi phân tích, đọc kỹ các qui tắc GLP dưới đây.

A.2 Thuốc thử

A.2.1 Chỉ sử dụng các enzym thuộc loại qui định (hoạt tính riêng, nồng độ, chất nhiễm bẩn có hoạt tính enzym, dung môi).

A.2.2 Chỉ sử dụng các coenzym thuộc loại qui định (loại tinh khiết, dạng muối hoặc axit, các chất nhiễm bẩn).

A.2.3 Tất cả các loại thuốc thử khác với enzym và coenzym phải thuộc loại phân tích.

...

...

...

A.2.5 Nước dùng để chuẩn bị các dung dịch mẫu phải là loại đã được chưng cất bằng dụng cụ thuỷ tinh hoặc đã khử ion.

A.2.6 Bảo quản các thuốc thử và các dung dịch/huyền phù enzym theo các chỉ dẫn (thường được bảo quản ở nhiệt độ từ 2 ^oC  đến 8 °C).

A.2.7 Không làm đông lạnh các huyền phù enzym.

A.2.8 Khi thuốc thử đã quá hạn sử dụng, thì loại bỏ hoặc kiểm tra hiệu quả của thuốc thử bằng cách kiểm tra các dung dịch chuẩn bằng với các lượng chất phân tích khác nhau. Các độ hấp thụ thu được phải tỷ lệ thuận với các nồng độ.

A.2.9 Các dung dịch đệm được lấy ra từ tủ lạnh phải được làm ấm đến nhiệt độ phòng trước khi cho vào hỗn hợp phân tích.

A.3 Cuvet đo phổ và quang phổ

A.3.1 Sử dụng cuvet bằng thuỷ tinh hoặc bằng chất dẻo có chiều dài đường quang 1 cm.

CHÚ THíCH Các cuvet bằng chất dẻo có các ưu điểm hơn các cuvet bằng thuỷ tinh như sau:

a) giá rẻ (có thể dùng một lần);

...

...

...

c) trong cùng một mẻ, các cuvet bằng chất dẻo cho độ hấp thu giống nhau.

A.3.2 Bất kỳ khi nào một mẻ cuvet mới được đưa vào sử dụng, thì kiểm tra chiều dài đường quang của chúng dựa vào các cuvet chuẩn (ví dụ: cuvet thạch anh), như sau:

Đổ đầy nước vào cuvet chuẩn và cuvet bằng chất dẻo rồi đo độ hấp thụ (A₁) của từng cuvet dựa vào nước. Sau khi tráng sạch, đổ đầy dung dịch NADH (khoảng 0,15 mg/ml) và đo độ hấp thụ (A₂) dựa vào nước. Tính A₂ - A₁, đối với cả hai cuvet chuẩn và cuvet bằng chất dẻo này. Nếu chênh lệch của (A₂ - A₁) giữa hai loại cuvet này vượt quá 0,5 % của phép đo độ hấp thụ đối với cuvet chuẩn, thì tính phần trăm chênh lệch trung bình và được tính đến đối với chiều dài đường quang, /, bằng công thức (3).

A.3.3 Luôn luôn sử dụng các cuvet sạch, không bị xước. Chỉ dùng khăn lau mềm để lau khô hoặc làm sạch các mặt của cuvet quang.

A.3.4 Không nên đo độ hấp thụ của các cuvet mẫu thử dựa vào độ hấp thụ của cuvet mẫu trắng, vì sẽ không thu được thông tin về cường độ hấp thụ của chính mẫu thử trắng. Đo độ hấp thụ của mẫu thử và cuvet thử trắng dựa vào nước và tính độ chênh lệch.

A.3.5 Không đo độ hấp thụ của mẫu hoặc cuvet thử trắng dựa vào cuvet rỗng (vì khuếch tán ánh sáng).

A.3.6 Dùng dao trộn để trộn đều các lượng chứa trong cuvet hoặc bằng cách dùng parafilm hàn kín cuvet rồi xoay cuvet.

A.3.7 Đuổi bỏ bọt khí ra khỏi cuvet bằng dao trộn. Tránh làm xước mặt quang của cuvet.

A.3.8 Luôn luôn sử dụng cùng một loại cuvet để đo mẫu thử và đo mẫu trắng.

...

...

...

A.4 Máy đo phổ và máy đo quang phổ

A.4.1 Sử dụng máy đo quang phổ (độ rộng dải < 10 nm), gồm một máy đo quang có lọc với bộ lọc nhiễu (độ rộng dải < 10 nm), hoặc máy đo quang phổ vạch có đèn hơi thuỷ ngân. Sử dụng máy đo quang phổ hoặc máy đo quang có lọc để đo ở độ hấp thụ cực đại của NADH hoặc NADPH, nghĩa là ở 340 nm. Thực hiện đo sử dụng máy đo quang phổ vạch có đèn hơi thuỷ ngân ở 365 nm hoặc 344 nm.

CHÚ THÍCH Các hệ số hấp thụ phân tử của NADH hoặc NADPH được đo ở 334 nm, 340 nm và 365 nm như sau:

a) NADH hoặc NADPH ở 334 nm (Hg): 6,18 x 10⁶ cm²/mol;

b) NADH hoặc NADPH ở 340 nm: 6,3 X 10⁶ cm²/mol;

c) NADPH ở 365 nm (Hg): 3,5 X 10⁶ cm²/mol;

d) NADH ở 365 nm: 3,4 x 10⁶ cm²/mol;

A.4.2 Mối liên quan tuyến tính giữa độ hấp thụ và nồng độ của NADH hoặc NADPH tồn tại cho đến độ hấp thụ 2,0. Kiểm tra độ tuyến tính như sau:

a) dùng pipet lấy 2,00 ml nước cất cho vào cuvet và đo độ hấp thụ A₀ dựa vào nước;

...

...

...

Tính độ hấp thụ bị giảm, A_m, bằng công thức sau:

Lặp lại qui trình kiểm tra tuyến tính 14 lần như mô tả ở trên.

Sau mỗi cặp phép đo, tính độ hấp thụ bị giảm, A_m, bằng công thức sau:

trong đó

A_n là độ hấp thụ thu được tại phép đo thứ n;

V là thể tích của lượng chứa trong cuvet tại đo thứ n.

Mỗi lần đo, vẽ đồ thị giữa thể tích của dung dịch NADH có trong cuvet và độ hấp thụ giảm tương ứng.

...

...

...

A.5.1 Sử dụng pipet tự động và các dụng cụ phân phối khác theo chỉ dẫn của nhà sản xuất.

A.5.2 Sử dụng các đầu tip thích hợp cho từng pipet.

A.5.3 Kiểm tra định kỳ (ví dụ: kiểm tra hàng tháng) các yêu cầu về dung tích và độ lăp lại của các pipet tự động và các dụng cụ phân phối khác như sau:

Cân cốc thuỷ tinh có mỏ cùng với nước tại thời điểm t. Sau đó dùng pipet hoặc dụng cụ phân phối khác lấy một lượng nước đo được cho vào cốc có mỏ và cân chính xác tại thời điểm (t + 1) sau lần cân thứ nhất. Lặp lại qui trình hút pipet hoặc dùng dụng cụ phân phối chín lần. Không sử dụng pipet hoặc dụng cụ phân phối, cân cốc có mỏ tại các thời điểm thứ (t + 11), (t + 12), (t + 13), (t + 14) và (t + 15) phút. Tính hao hụt khối lượng do bay hơi sau mỗi phút. Tính thể tích và độ lặp lại của mỗi pipet hoặc mỗi dụng cụ phân phối, có tính đến hao hụt lượng nước đã bay hơi.

A.5.4 Nhiệt truyền từ lòng bàn tay trong suốt quá trình sử dụng có thể ảnh hưởng đến dung tích của một số pipet tự động.

Kiểm tra hiện tượng này bằng qui trình mô tả trong A.5.3 và tránh sử dụng các pipet như thế.

A.5.5 Ngay trước khi sử dụng, tráng đầu tip vài lần bằng dung dịch/huyền phù cần phân phối. Đối với mỗi dung dịch mẫu, sử dụng một pipet mới.

A.5.6 Dùng pipet hút dung dịch mẫu, dung dịch đệm, enzym, coenzym, trong khi đầu tip càng ngập sâu trong cuvet càng tốt và tại các vị trí khác nhau trong cuvet.

Có thể dùng pipet để lấy các lượng nhỏ dung dịch/huyền phù enzym (10  - 15 ) cho lên dao trộn đưa vào cuvet và dùng dao trộn để trộn đều lượng chứa trong cuvet.

...

...

...

A.6 Các thông tin bổ ích khác

A.6.1 Kiểm tra khả năng gây nhiễu và sai số chéo bằng cách xác định độ hấp thụ của hai dung dịch có các nồng độ chất phân tích khác nhau. Độ hấp thụ thu được phải tỷ lệ thuận với nồng độ của chất phân tích.

A.6.2 Sử dụng chất chuẩn để kiểm tra các phản ứng enzym. Chất chuẩn này được coi là chuẩn làm việc.

CHÚ THÍCH Các chất chuẩn phải có độ tinh khiết được công nhận bởi cơ quan chuẩn Quốc gia.

A.6.3 Tiến hành phép thử thu hồi với sự có mặt của dung dịch mẫu. Lượng chất phân tích được bổ sung vào phải gần giống với lượng vốn có trong dung dịch mẫu.

A.6.4 Sử dụng một dao trộn bằng chất dẻo cho một cuvet hoặc mỗi lần chỉ sử dụng một dao trộn.

CHÚ THÍCH Lượng chất lỏng còn dính trên dao trộn có thể coi như không đáng kể.

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

...

...

...

[2] TCVN 7084:2002 (ISO 1736:2000) Sữa bột và sản phẩm sữa bột. Xác định hàm lượng chất béo. Phương pháp khối lượng (phương pháp chuẩn).

[3] TCVN 6910-1:2001 (ISO 5725-1:1994) Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo. Phần 1: Nguyên tắc và định nghĩa chung.

[4] TCVN 6910-2:2001 (ISO 5725-2:1994) Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo. Phần 2: Phương pháp cơ bản xác định độ lặp lại và độ tái lập của phương pháp đo tiêu chuẩn.

[5] LEENHEER J. and JANS J.A. Bulletin of the IDF, No.207, 1986, pp. 122-132.