9.4.8. Giữ cả hai bình chiết chất béo tại bầu nhỏ, cẩn thận gạn được càng nhiều càng tốt lớp nổi trên bề mặt vào cùng một bình nhận chất béo (xem 9.3) có chứa một ít chất trợ sôi (6.10) trong trường hợp bình đun sôi hoặc bình nón (còn đối với đĩa kim loại thì tùy chọn). Không gạn bất kỳ một tí chất lỏng nào vào bình (xem hình 2).

9.4.9. Tráng phía ngoài cổ của cả hai bình chiết chất béo bằng một ít dung môi hỗn hợp (5.6). Thu lấy nước tráng của cả hai bình cho vào cùng một bình nhận chất béo trong 9.4.8. Chú ý không để dung môi hỗn hợp tràn ra thành ngoài của bình chiết. Nếu cần, có thể loại bỏ dung môi hoặc một phần dung môi khỏi bình nhận bằng cách chưng cất hoặc làm bay hơi như mô tả trong 9.4.13.

9.4.10. Thêm 5 ml etanol (5.2) vào cả hai bình chiết chất béo. Dùng etanol để tráng thành trong cổ bình và trộn như mô tả trong 9.4.3.

9.4.11. Thực hiện chiết lần hai bằng cách lặp lại các thao tác như mô tả trong 9.4.4 đến hết 9.4.9. Thay cho 25 ml chỉ dùng 15 ml ete dietyl (5.4) và 15 ml xăng nhẹ (5.5). Dùng ete dietyl để tráng thành trong cổ của cả hai bình chiết.

Nếu cần, nâng nhẹ lớp phân cách đến giữa cổ của một hoặc cả hai bình bằng cách thêm nước dọc theo thành bình (xem hình 1) để có thể gạn dung môi càng nhiều càng tốt (xem hình 2).

9.4.12. Thực hiện chiết lần ba, không cho thêm etanol, bằng cách lặp lại các thao tác như mô tả trong 9.4.4 đến hết 9.4.9. Lặp lại thao tác, nhưng chỉ dùng 15 ml ete dietyl (5.4) và 15 ml xăng nhẹ (5.5). Dùng ete dyetyl để tráng lại phía trong cổ cả hai bình chiết chất béo.

Nếu cần, nâng nhẹ mặt lớp phân cách đến giữa cổ của một hoặc cả hai bình bằng cách thêm nước dọc theo thành bình (xem hình 1) để có thể gạn dung môi càng nhiều càng tốt (xem hình 2).

9.4.13. Loại bỏ các dung môi (kể cả etanol) càng nhiều càng tốt khỏi bình thu nhận chất béo, bằng cách chưng cất nếu sử dụng bình đun sôi hoặc bình nón, hoặc bằng cách cho bay hơi nếu sử dụng cốc có mỏ hoặc đĩa (xem 6.3). Tráng phía trong cổ bình đun sôi hoặc bình nón bằng một ít dung môi hỗn hợp (5.6) trước khi bắt đầu chưng cất.

9.4.14. Làm nóng bình thu nhận chất béo với bình đun sôi hoặc bình nón 1 h trong tủ sấy (6.4) ở nhiệt độ 102 ^oC, đặt bình nằm nghiêng để hơi dung môi thoát ra được. Lấy bình thu nhận chất béo ra khỏi tủ sấy và kiểm tra chất béo thu được đã trong hay chưa. Nếu chất béo không trong, chứng tỏ có mặt tạp chất trong chất béo và phải lặp lại toàn bộ qui trình. Nếu chất béo trong, bảo vệ bình thu nhận chất béo khỏi bụi và để nguội bình (không nên để trong bình hút ẩm) tới nhiệt độ phòng cân (đối với bình thủy tinh tối thiểu 1 h, đĩa kim loại tối thiểu 30 min).

...

...

...

9.4.15. Làm nóng bình thu nhận chất béo với bình đun sôi hoặc bình nón 30 min trong tủ sấy (6.4) ở nhiệt độ 102^oC, đặt bình nằm nghiêng để nơi dung môi thoát ra được. Để nguội và cân lại theo mô tả trong 9.4.14. Nếu cần, lặp lại qui trình làm nóng và qui trình sấy cho đến khi khối lượng của bình thu nhận chất béo giảm khoảng 1,0 mg hoặc ít hơn, hoặc tăng giữa hai lần cân liên tục. Ghi khối lượng tối thiểu là khối lượng của bình thu nhận chất béo và của chất chiết được.

10. Tính toán và biểu thị kết quả

10.1. Tính toán

Tính hàm lượng chất béo của mẫu theo công thức:

trong đó

w_f là phần khối lượng chất béo có trong mẫu, tính bằng phần trăm;

m₀ là tổng khối lượng của hai phần mẫu thử (9.1), tính bằng gam;

m₁ là khối lượng của bình thu nhận chất béo và chất chiết được, xác định trong 9.4.15, tính bằng gam;

...

...

...

m₃ là khối lượng của bình thu nhận chất béo được dùng trong thử mẫu trắng (9.2) và chất chiếc xác định được trong 9.4.15, tính bằng gam;

m₄ là khối lượng của bình thu nhận chất béo (9.3) được dùng trong thử mẫu trắng (9.2), tính bằng gam.

10.2. Biểu thị kết quả

Làm tròn kết quả đến chữ số thứ ba sau dấu phẩy.

11. Độ chính xác

11.1. Thử liên phòng thí nghiệm

Các chi tiết thử liên phòng thí nghiệm về độ chính xác của các phương pháp đã được ban hành phù hợp với TCVN 4550 - 88 (ISO 5725) (xem tài liệu tham khảo [6]).

Giá trị về giới hạn độ lặp lại và độ tái lập được biểu thị ở 95% mức tin cậy và có thể không áp dụng cho các khoảng nồng độ và matrix khác với giá trị đã nêu.

11.2. Độ lặp lại

...

...

...

11.3. Độ tái lập

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm riêng rẽ, sử dụng cùng một phương pháp trên cùng một nguyên liệu thử, do các nhà phân tích khác nhau sử dụng các thiết bị giống nhau, thực hiện trong các phòng thí nghiệm khác nhau trong khoảng thời gian ngắn, lớn hơn 0,015% phần khối lượng không vượt quá 5% các trường hợp.

12. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải nêu rõ:

- mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ mẫu thử;

- phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

- phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

- tất cả các chi tiết thao tác không qui định trong tiêu chuẩn này, hoặc tùy ý lựa chọn, cùng với mọi chi tiết bất thường nào khác có thể ảnh hưởng tới kết quả;

- việc hiệu chuẩn đã thực hiện, nếu giá trị thu được trong thử mẫu trắng để kiểm tra phương pháp vượt quá 2,5 mg.

...

...

...

- nếu độ lặp lại được kiểm tra, nêu kết quả cuối cùng thu được.

PHỤ LỤC A

(tham khảo)

Các chú ý về cách tiến hành

A.1. Thử mẫu trắng để kiểm tra thuốc thử (xem 9.2.2)

Trong trường hợp thử mẫu trắng, sử dụng bình thu nhận chất béo dùng cho mục đích kiểm tra khối lượng để các thay đổi trong điều kiện môi trường của phòng cân hoặc ảnh hưởng nhiệt độ của bình thu nhận chất béo không làm ảnh hưởng đến việc xem xét sự có mặt hay không có mặt của chất không bay hơi có trong phần chiết của thuốc thử. Bình này có thể được dùng như bình đối trọng trong trường hợp cân có hai đĩa cân. Mặt khác, chênh lệch khối lượng biểu kiến (m₃ - m₄ trong 10.1) của bình thu nhận chất béo dùng cho mục đích kiểm tra, cần được xem xét khi kiểm tra khối lượng của bình thu nhận chất béo dùng để thử mẫu trắng. Do đó, chênh lệch khối lượng biểu kiến của bình thu nhận chất béo, được hiệu chỉnh cho thay đổi khối lượng biểu kiến của bình thu nhận chất béo dùng cho mục đích kiểm tra, sẽ không tăng quá 1,0 mg.

Rất hiếm khi dung môi có chứa chất bay hơi bị giữ lại nhiều trong chất béo. Nếu thấy sự có mặt của các chất như thế, cần tiến hành thử mẫu trắng đối với tất cả các thuốc thử và từng dung môi sử dụng bình thu nhận chất béo với khoảng 1 g butterfat khan. Nếu cần, chưng cất lại các dung môi với 1 g butterfat trong 100 ml dung môi. Chỉ dùng các dung môi này trong khoảng thời gian ngắn sau khi chưng cất lại.

A.2. Tiến hành thử mẫu trắng đồng thời với việc xác định (xem 9.2.1)

...

...

...

Trong các điều kiện thích hợp (giá trị thấp trong thử mẫu trắng về thuốc thử, nhiệt độ cân bằng của phòng cân, thời gian làm đủ nguội cho bình đựng chất béo), giá trị này thường nhỏ hơn 0,5 mg và sau này có thể bỏ qua trong phần tính kết quả ở trường hợp xác định thông thường. Giá trị hơi lớn hơn (dương và âm) lên đến 2,5 mg cũng thường gặp. Sau khi điều chỉnh các giá trị này, các kết quả sẽ đúng. Khi điều chỉnh giá trị lớn hơn 2,5 mg thì phải nêu trong phần báo cáo kết quả (điều 12).

Nếu giá trị thu được trong phần thử mẫu trắng thường lớn hơn 1,0 mg, thì nên kiểm tra lại thuốc thử nếu như thuốc thử chưa được kiểm tra. Thuốc thử có lẫn tạp chất hoặc có vết thì cần phải thay thế hoặc làm sạch (xem 9.2.2 và A.1).

A.3. Thử peroxit

Để thử peroxit, thêm 1 ml dung dịch kali iodua 100 g/l mới chuẩn bị vào 10 ml dietyl ete đựng trong ống đong nhỏ có nắp thủy tinh trước đó đã được tráng bằng ete. Lắc ống đong và sau đó để yên trong 1 min. Không quan sát thấy màu vàng trong lớp dietyl ete.

Có thể sử dụng các phương pháp thử nghiệm thích hợp khác đối với peroxit.

Để đảm bảo cho dietyl ete không chứa peroxit, xử lý ete ít nhất là ba ngày trước khi sử dụng như sau:

Cắt lá kẽm thành những dải để ít nhất là chúng chạm được đến nửa chai đựng dietyl ete, dùng khoảng 80 cm² lá kẽm cho 1 lít ete dietyl.

Trước khi sử dụng, nhúng toàn bộ các dải lá kẽm này 1 min trong dung dịch chứa 10 g đồng (II) sunfat ngậm 5 nước (CuSO₄.5H₂O) và 2 ml/l axit sunfuric đậm đặc [98%(m/m)].

Rửa kỹ các dải này nhẹ nhàng bằng nước, rồi đặt các dải đã mạ đồng còn ướt này vào trong chai đựng dietyl ete và để các dải này trong chai.

...

...

...

A.4. Ete dietyl có chứa chất chống oxi hóa

Ete dietyl có chứa khoảng 1 mg/kg chất chống oxi hóa có bán sẵn ở một số nước, đặc biệt dùng để xác định chất béo. Hàm lượng này không dùng cho mục đích đối chứng.

Ở một số nước khác, ete dietyl có bán sẵn với hàm lượng chất chống oxi hóa cao hơn, thí dụ như lên đến 7mg/kg. Những ete như thế chỉ nên sử dụng cho các phép xác định thông thường với các phép thử mẫu trắng bắt buộc tiến hành đồng thời với việc xác định để điều chỉnh những sai số hệ thống do dư lượng chất chống oxi hóa gây ra. Đối với mục đích đối chứng, ete dietyl này phải được chưng cất trước khi sử dụng.

A.5. Etanol

Có thể sử dụng etanol đã bị biến tính mà không phải do metanol với điều kiện là chất làm biến tính đó không ảnh hưởng đến kết quả xác định.

PHỤ LỤC B

(tham khảo)

Qui trình khác dùng ống chiết chất béo có si phông hoặc có nối với chai rửa

...

...

...

Nếu sử dụng ống chiết chất béo có si phông hoặc nối với chai rửa thì tiến hành theo qui định trong phụ lục này. Các ống phải có nút bần chất lượng tốt như qui định đối với bình trong 6.6 (xem hình B.1 làm thí dụ).

B.2. Cách tiến hành

B.2.1. Chuẩn bị mẫu thử

Xem điều 8.

B.2.2. Phần mẫu thử

Tiến hành theo qui định trong 9.1 nhưng dùng các ống chiết chất béo (xem chú thích trong 6.6 và hình B.1). Hai phần mẫu thử này phải cố gắng chuyển được hết lên đáy của từng ống chiết chất béo.

B.2.3. Thử mẫu trắng

Xem 9.2 và A.2.

B.2.4. Chuẩn bị bình thu nhận chất béo

...

...

...

B.2.5. Tiến hành xác định

B.2.5.1. Tiến hành ngay phép xác định.

Thực hiện các thao tác mô tả trong B.2.5.2 đến B.2.5.13 trên cả hai phần mẫu thử đã xử lý sơ bộ (B.2.2).

B.2.5.2. Cho 2 ml dung dịch amoniac (5.1), hoặc một thể tích tương ứng của dung dịch amoniac đậm đặc hơn (xem chú thích ở 5.1) vào cả hai phần mẫu thử đựng trong các ống chiết chất béo (B.2.2). Lắc kỹ phần mẫu thử đã xử lí sơ bộ trên đáy các ống chiết chất béo.

B.2.5.3. Thêm 10 ml etanol (5.2). Lắc kỹ một cách nhẹ nhàng phần trên đáy của hai ống chiết chất béo. Nếu cần, thêm 2 giọt dung dịch đỏ Congo (5.3).

B.2.5.4. Thêm 25 ml ete dietyl (5.4). Đậy các ống chiết chất béo bằng nút bần đã bão hòa nước (xem 6.6) hoặc bằng nắp làm bằng chất liệu khác đã làm ướt bằng nước (xem 6.6). Lắc mạnh cả hai ống, nhưng không quá mạnh (để tránh tạo nhũ) bằng cách đảo chiều trong khoảng 1 min. Nếu cần, làm mát các ống này dưới dòng nước chảy. Sau đó cẩn thận mở nút và tráng nút và cổ các ống này bằng một ít dung môi hỗn hợp (5.6). Dùng chai rửa (6.8) để cho nước rửa chảy vào ống chiết.

B.2.5.5. Thêm 25 ml xăng nhẹ (5.5). Đậy ống chiết chất béo bằng nút bần hoặc nút khác đã thấm lại nước (bằng cách ngâm vào trong nước). Lắc nhẹ ống 30 s như mô tả trong B.2.5.4.

B.2.5.6. Li tâm từ 1 min đến 5 min hai ống chiết chất béo đã đậy nút, ở 80 g đến 90 g. Nếu không có máy li tâm, đặt ống trên giá đỡ (6.7) ít nhất 30 min cho đến khi thấy có lớp nổi lên bề mặt rõ rệt và phân biệt rõ với lớp chất lỏng. Nếu cần, làm mát ống nghiệm dưới dòng nước chảy đến nhiệt độ phòng.

B.2.5.7. Cẩn thận tháo bỏ nút, tráng nút và cổ của hai ống chiết chất béo bằng một ít dung môi hỗn hợp (5.6). Dùng chai rửa (6.8) để cho nước rửa chảy vào ống.

...

...

...

Cẩn thận gạn được càng nhiều càng tốt lớp nổi trên bề mặt của cả hai ống chiết chất béo cho vào cùng một bình nhận chất béo (9.3) có chứa một ít chất trợ sôi (6.10) trong trường hợp đối với bình đun sôi hoặc bình nón (còn đối với đĩa kim loại thì tùy chọn). Tránh bất kỳ một tí nào của lớp chất lỏng lẫn vào. Tráng phía ngoài khớp nối bằng một ít dung môi hỗn hợp, thu lấy nước rửa vào bình thu nhận chất béo.

Chú thích - Lớp nổi phía trên có thể được chuyển ra khỏi ống chiết, thí dụ dùng bầu cao su được nối với một đoạn ống để tạo áp suất.

B.2.5.9. Tháo khớp nối khỏi cổ của hai ống nghiệm. Nâng nhẹ ống nối và tráng phần dưới của ống nối trong bằng một ít dung môi hỗn hợp (5.6). Hạ thấp và chèn lại ống nối và chuyển cả hai phần nước rửa vào cùng một bình thu nhận chất béo.

Tráng rửa khớp nối bằng một ít dung môi hỗn hợp, cho nước rửa vào cùng một bình nhận chất béo. Nếu cần, loại bỏ dung môi hoặc một phần dung môi khỏi bình nhận bằng cách chưng cất  hoặc làm bay hơi như mô tả trong 9.4.13.

B.2.5.10. Tháo lại khớp nối khỏi cổ của các ống. Nâng nhẹ ống nối và thêm 5 ml etanol vào cả hai ống chiết chất béo. Dùng etanol để tráng thành trong của khớp nối. Lắc đều như mô tả trong B.2.5.3.

B.2.5.11. Thực hiện chiết lần hai bằng cách lặp lại các thao tác như mô tả trong B.2.5.4 đến hết B.2.5.9. Thay 25 ml bằng 15 ml ete dietyl (5.4) và 15 ml xăng nhẹ (5.5). Dùng ete dietyl để tráng thành trong của cả hai khớp nối trong suốt quá trình tháo khớp nối ra khỏi hai ống chiết chất béo sau lần chiết lần trước đó.

B.2.5.12. Thực hiện chiết lần ba, không cho thêm etanol, bằng cách lặp lại các thao tác như mô tả trong B.2.5.4 đến B.2.5.9. Lặp lại các thao tác nhưng chỉ sử dụng 15 ml ete dietyl và 15 ml xăng nhẹ. Dùng ete dietyl để tráng thành trong của các khớp nối như mô tả trong B.2.5.11.

B.2.5.13. Tiến hành tiếp như mô tả trong 9.4.13 đến 9.4.15.

Kích thước tính bằng milimet

...

...

...

1 Thể tích ở mức khi đã tháo khớp nối 105 ml ± 5 ml.

2 Độ dày của thành ống 1,5 mm ± 0,5 mm.

Hình B.1 - Các thí dụ của ống chiết chất béo

Tài liệu tham khảo

[1] TCVN 6400:1998 (ISO 707) Sữa và sản phẩm sữa - Lấy mẫu.

[2] TCVN 6508:1999 (ISO 1211) Sữa - Xác định hàm lượng chất béo - Phương pháp khối lượng (phương pháp chuẩn).

[3] TCVN 4550-88 (ISO 5725:1986) Độ chính xác của các phương pháp thử - Xác định độ lặp lại và độ tái lập đối với phương pháp thử chuẩn bằng thử liên phòng thí nghiệm.

[4] ISO 5725-1:1994 Độ chính xác của các phương pháp đo và các kết quả. Phần 1: Các nguyên tắc chung và các định nghĩa.

...

...

...

[6] Liên đoàn sữa quốc tế. Nghiên cứu cộng tác liên phòng thí nghiệm, Second series. Bult. Int. Dairy Fed., Số 235, 1988.