Đun sôi để hòa tan các thành phần trong nước.

Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng sẽ là 7,2 ± 0,1 ở 25^oC.

Phân phối vào các ống nghiệm, mỗi ống 10 ml môi trường.

Khử trùng môi trường này trong 15 phút ở 121^oC ± 1^oC.

Chú thích - Để kiểm tra các mẫu nước với lượng nhiều hơn 1 ml, cần chuẩn bị môi trường canh thang nồng độ kép có các thể tích bằng thể tích của mẫu thử.

6.2.2. Môi trường thạch mật- aesculin-nitrua

tripton

17,0 g

pepton

...

...

...

cao men

5,0 g

mật bò khô

10,0 g

natri clorua (NaCl)

5,0 g

aesculin

1,0 g

amoni sắt (III) xitrat

...

...

...

natri nitrua (NaN₃)

0,15 g

thạch

từ 12 g đến 20 g (theo chỉ dẫn của nhà sản xuất)

nước vừa đủ

1000 ml

Hòa tan các thành phần trên trong nước bằng cách đun sôi.

Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng, pH sẽ là 7,2 ± 0,1 ở 25 °C.

Phân phối vào các bình chứa cho phù hợp.

...

...

...

Làm nguội đến 50 °C tới 60 °C và rót vào các hộp Petri để có được dộ dày môi trường ít nhất là 3mm và để yên trên một mặt phẳng ngang, chỗ mát.

6.3. Dung dịch hydro peroxit (oxi già) 30 g/l.

7. Thiết bị

Các thiết bị thông thường của phòng thí nghiệm vi sinh vật, và:

7.1. Tủ ấm, có thể duy trì nhiệt độ ở 35^oC ± 1^oC hoặc 37^oC ± 1^oC

7.2. Tủ ấm, có thể duy trì nhiệt độ ở 44^oC ± 0,5^oC

7.3. Nồi hấp áp lực, có thể duy trì nhiệt độ ở 121^oC ± 1^oC

8. Lấy mẫu

Xem ISO 5667-1, TCVN 5992:1995 (ISO 5662 – 2) và TCVN 5993 : 1995 (ISO 5662 – 3 ).

...

...

...

9.1. Xử lý mẫu

Các qui trình chung, như xử lý mẫu và chuẩn bị các dung dịch pha loãng sẽ được xây dựng thành tiêu chuẩn trong thời gian tới.

9.2. Tăng sinh

Cho 1 ml mẫu (hoặc mẫu pha loãng) vào 10ml canh thang glucoza-nitrua (6.2.1) và trộn kỹ.

Các lượng mẫu lớn hơn 1 ml cần cho vào canh thang nồng độ kép với cùng thể tích

Nuôi ấm ở 35^oC ± 1^oC hoặc 37^oC ± 1^oC trong 22^h ± 2 ^h.

Coi tất cả các ống nghiệm có xuất hiện màu vàng (ở toàn bộ ống hay chỉ ở thành phần dưới ống) là cho phản ứng dương tính, nuôi ấm lại các ống nghiệm âm tính trong một khoảng thời gian 22^h ± 2 ^h nữa.

Sau giai đoạn nuôi ấm này, thậm chí sự chuyển màu yếu thành màu đỏ nhạt cũng được coi là dấu hiệu của sự tạo thành axit. Để rõ ràng cần so sánh với màu của ống môi trường không cấy mẫu thử.

Để có kết quả định lượng, cần sử dụng phương pháp “số có xác xuất cao nhất” (MNP).

...

...

...

Khẳng định mỗi ống cấy tăng sinh có biểu hiện sinh axit như sau:

Lấy một vòng que cấy từ ống canh thang tăng sinh nghi ngờ, cấy ria lên một đĩa thạch mật-aesculin-nitrua (6.2.2).

Nuôi trong tủ ấm ở 44^oC ± 0,5^oC trong 44 ^h ± 4 ^h.

Tất cả các đĩa cho thấy các khuẩn lạc có màu từ nâu tới đen và/hoặc có màu nâu hay đen ở phần môi trường xung quanh được coi là phản ứng dương tính.

9.4. Phép thử catalaza

Nhỏ một giọt dung dịch oxi già (hydro peroxit) (6.3) lên khuẩn lạc trên môi trường thạch mật-aesculin-nitrua.

Việc xuất hiện bọt nhỏ oxi chứng tỏ là các sinh vật cho phản ứng catalaza dương tính. Chỉ có các khuẩn lạc catalaza âm tính mới được coi là liên cầu phân.

Chú thích - Để loại trừ các sai lầm do các phản ứng catalaza âm tính giả có thể xảy ra trên môi trường thạch mật-aesculin-nitrua, phép thử này có thể làm lại trên một mẫu cấy truyền lên một môi trường không chọn lọc khác.

10. Biểu thị kết quả

...

...

...

11. Báo cáo kết quả

Báo cáo kết quả sẽ bao gồm các thông tin sau:

a) tham khảo tiêu chuẩn này;

b) mọi chi tiết cần thiết đối với sự nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

c) phương pháp khẳng định được dùng;

d) các kết quả như đã nêu ở mục 10 tính theo số có xác xuất lớn nhất của liên cầu phân trong thể tích mẫu thử.