Phương pháp xác định nồng độ ADN trong dung dịch

Phương pháp xác định nồng độ ADN trong dung dịch (Ảnh minh họa)

Cụ thể, tại Phụ lục quy trình kỹ thuật phân tích định tính, định lượng Axit Deoxyribonucleic ban hành kèm theo Thông tư 13/2013/TT-BTNMT quy định phương pháp thông dụng để xác định nồng độ ADN trong dung dịch:

Phương pháp điện di: ADN được phân tách bằng phương pháp điện di trên khuôn gel agarose dựa trên điện tích và phân tử lượng của chính nó. Sau khi điện di, bản gel được nhuộm bằng dung dịch Ethidium bromide (EtBr), EtBr sẽ liên kết vào các phân tử ADN và khi được kích thích bằng ánh sáng UV sẽ phát huỳnh quang da cam. Do lượng huỳnh quang tỉ lệ với lượng ADN tổng số, nên số lượng ADN có trong mẫu có thể được ước tính bằng cách so sánh huỳnh quang được tạo ra bởi mẫu chưa biết với một dãy định lượng chuẩn.

Đo hàm lượng ADN bằng quang phổ: Các acid nucleic trong dung dịch sẽ hấp thụ ánh sáng tia cực tím (UV) trong dải từ 210 nm đến 300 nm với độ hấp thụ cực đại ở 260 nm. Vì các ADN và RNA và các nucleotide cùng có độ hấp thụ cực đại ở 260 nm, nên ADN không thể xác định bằng máy đo quang phổ trong vùng cực tím khi dung dịch bị nhiễm nucleotide và RNA. Do vậy RNA cần được loại bỏ bằng phương pháp thủy phân với enzyme RNase. Các nucleotide và oligonucleotide thu được từ thủy phân RNA cũng cần được loại bỏ, nếu không loại bỏ sẽ dẫn đến đánh giá thừa hàm lượng ADN của mẫu thử. Ngoài ra ADN xoắn kép hấp thụ ánh sáng UV ít hơn ADN xoắn đơn nên cần lưu ý đến hệ số hấp thụ khi tính toán nồng độ.

Việc chuẩn máy đo quang phổ cần được thực hiện định kỳ bằng cách đo nồng độ của các dung dịch ADN đối chứng.

Chi tiết xem thêm Thông tư 13/2013/TT-BTNMT, có hiệu lực từ 05/8/2013.   

Lê Vy

>> XEM BẢN TIẾNG ANH CỦA BÀI VIẾT NÀY TẠI ĐÂY