Phương pháp phát hiện và nhận dạng ADN bằng kỹ thuật PCR

Phương pháp phát hiện và nhận dạng ADN bằng kỹ thuật PCR (Ảnh minh họa)

Cụ thể, tại Phụ lục quy trình kỹ thuật phân tích định tính, định lượng Axit Deoxyribonucleic ban hành kèm theo Thông tư 13/2013/TT-BTNMT quy định phương pháp phát hiện và nhận dạng ADN của sinh vật biến đổi gen bằng kỹ thuật PCR bao gồm:

Phương pháp đặc hiệu taxon – đích: Taxon là cấp phân loại, đơn vị phân loại. Taxon đích là đơn vị phân loại của sinh vật biến đổi gen. Đây là phương pháp thông thường để phát hiện trình tự ADN trong một taxon đích, thường là một loài nhưng có thể là cấp phân loại nhỏ hơn hoặc cao hơn. Các phương pháp dựa vào taxon đích để đánh giá sự có mặt, chất lượng và số lượng ADN có nguồn gốc từ taxon và đôi khi còn được sử dụng là đơn vị chuẩn để định lượng tương đối vật liệu có nguồn gốc biến đổi gen.

Phương pháp sàng lọc PCR để phát hiện ADN của sinh vật biến đổi gen: Phát hiện các yếu tố di truyền thông thường đối với một số sinh vật biến đổi gen (chẳng hạn như gen khởi động, gen kết thúc hoặc một số yếu tố di truyền được quan tâm khác). Phương pháp sàng lọc nhanh và đáng tin cậy một số lượng lớn các mẫu thử.

Phát hiện sinh vật biến đổi gen bằng kỹ thuật PCR chủ yếu dựa vào các cặp mồi đặc hiệu cho vùng promoter và terminator. Hầu hết các trình tự ADN chuyển vào hệ gen thực vật dưới sự điều khiển CaMV 35S promoter, chỉ có một vài trường hợp sử dụng các promoter biểu hiện đặc hiệu ở phần chuyển hóa như rễ, thân, hạt... hay các promoter cảm ứng. Hiện nay rất nhiều các cây trồng biến đổi gen đã được cấp phép trồng mang ít nhất một bản sao của 35S promoter và T-Nos terminator (phân lập từ gen tổng hợp nopaline ở Agrobacterium tumefaciens). Một gen khác được sử dụng khá phổ biến là gen chọn lọc kanamycin nptII phân lập từ Escherichia coli transposon 5. Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens và virus khảm súp lơ (Cauliflower mosaic virus) đều nằm trong các danh mục các loài gây hại cho thực vật và đặc biệt virus khảm súp lơ ngoài gây bệnh cho súp lơ còn gây bệnh cho các thành viên khác thuộc họ Brassicceae (Cruciferae) cũng như họ Resedaceae và Solanaceae. Vì thế, kết quả dương tính từ các mẫu Brassicaceae, Resedceae và Solanaceae cần được xử lý cẩn thận. Để phân biệt giữa nhiễm virus và vật liệu biến đổi gen cần có phương pháp phát hiện virus.

Đối với động vật biến đổi gen, thường các promoter sử dụng có nguồn gốc hoặc từ động vật như methallothionein (MT), thymidine kinase, b-actin, amylase, insulin, b-lactoglobulin, adiposite P2 ... hoặc từ virus động vật như Simian virus (SV40), Rous sarcoma virus (RSV)... Tuy nhiên do các promoter có nguồn gốc từ động vật dễ gây ra nhầm lẫn với promoter nội sinh của vật chủ, nên các promoter có nguồn gốc từ virus động vật có thể được sử dụng để sàng lọc sự có mặt của ADN có nguồn gốc động vật.

Phương pháp nhận dạng cấu trúc đặc thù (event specific) để phát hiện trình tự gen đích của các sản phẩm biến đổi gen: Được sử dụng nhằm phát hiện sự tổ hợp của các trình tự ADN được đưa vào hệ gen vật chủ, cấu trúc này chỉ tìm thấy trong các dòng có nguồn gốc từ sinh vật biến đổi gen. Trường hợp để phát hiện ngô T25/"LibertyLink" kháng lại thuốc diệt cỏ nhờ biến đổi gen trong các nguyên liệu thô bằng cách khuếch đại vùng nối giữa trình tự ADN có nguồn gốc từ promoter 35S-CaMV và gen pat (gen kháng thuốc trừ cỏ). Phương pháp này không phân biệt được các giống ngô mà chỉ sử dụng để phát hiện sự có mặt của đoạn gen chuyển trong hạt và cây ngô.

Kích thước của đoạn gen đích sau khi khuếch đại bằng phản ứng PCR được xác định khi kích thước của sản phẩm PCR tương ứng với kích thước của đoạn ADN đích dự kiến. Các sản phẩm PCR được phân tích và xử lý bằng phương pháp điện di trên gel agarose và nhuộm bởi ethidium bromide. Gel agarose 1,5 % là thích hợp để phân tích các sản phẩm của PCR từ 150-1000 bp. Thang ADN chuẩn có kích thước trong khoảng 0,1

 Chi tiết xem thêm Thông tư 13/2013/TT-BTNMT, có hiệu lực từ 05/8/2013.   

Lê Vy

>> XEM BẢN TIẾNG ANH CỦA BÀI VIẾT NÀY TẠI ĐÂY