Định lượng ADN của sinh vật biến đổi gen bằng kỹ thuật real-time PCR

Định lượng ADN của sinh vật biến đổi gen bằng kỹ thuật real-time PCR (Ảnh minh họa)

Cụ thể, tại Phụ lục quy trình kỹ thuật phân tích định tính, định lượng Axit Deoxyribonucleic ban hành kèm theo Thông tư 13/2013/TT-BTNMT quy định Real-time PCR có thể được hiểu là phản ứng PCR động (kinetic PCR) mà trong đó số liệu phân tích được thu nhận thông qua phản ứng PCR, chính vì vậy mà sự nhân bản các gen đặc hiệu và việc phát hiện các sản phẩm có thể được kết hợp trong cùng một bước tiến hành thông qua việc sử dụng các loại chất phát huỳnh quang trong phản ứng. Cường độ huỳnh quang biểu thị nồng độ sản phẩm PCR tạo thành. Phản ứng được xác định sau các điểm thời gian (hoặc các chu kì PCR) mà trong đó sự nhân bản trình tự đích sẽ được phát hiện đầu tiên. Giá trị này được biểu thị với tên gọi là ngưỡng chu kì Ct (cycle threshold), đây chính là thời điểm mà cường độ huỳnh quang lớn hơn giá trị huỳnh quang cơ sở. Lượng ADN đích được nhân bản càng nhiều thì tín hiệu phát huỳnh quang càng nhanh, do vậy mà giá trị Ct sẽ càng thấp.

Trong real-time PCR, người ta thường sử dụng các loại thuốc nhuộm liên kết ADN sợi đôi (SYBR Green) để phát huỳnh quang, và các probe hoặc primer đặc hiệu chuỗi (trình tự) được đánh dấu huỳnh quang (TaqMan PCR). Thiết bị ổn nhiệt chu kỳ (máy PCR) đặc biệt được gắn với một module phát hiện tín hiệu huỳnh quang để theo dõi tiến trình phản ứng khi sự khuếch đại xảy ra. Tín hiệu huỳnh quang đo được phản ánh số lượng sản phẩm được khuếch đại trong mỗi chu kỳ.

Trong phân tích định lượng ADN của sinh vật biến đổi gen và các sản phẩm có nguồn gốc biến đổi gen, cần thiết phải xác định một gen chuẩn - gen tham chiếu (là gen nội sinh của sinh vật chuyển gen) để chuẩn hóa phương pháp. Gen chuẩn này phải phù hợp với các điều kiện: i) trình tự có tính đặc hiệu cao; ii) có một bản sao duy nhất trong bộ gen đoa bội, iii) biểu hiện ổn định trong các dòng khác nhau của cùng một loài. Do vậy trong real-time PCR định lượng cần có hai loại phản ứng cho gen đích và cho gen tham chiếu. Đối với phương pháp này thì hiệu quả nhân bản của các mẫu chuẩn và các mẫu nghiên cứu được coi là như nhau.

Để dựng đường chuẩn của gen đích cần tách chiết ADN tổng số của mẫu chuẩn (là ADN tách chiết từ vật liệu chuẩn đã được chứng nhận như ADN của sinh vật biến đổi gen hay ADN plasmid mang trình tự gen đích) và mẫu đối chứng âm (vật liệu chuẩn đã biết không chứa trình tự gen đích).

Ví dụ: trong phân tích định lượng ADN từ các sản phẩm có nguồn gốc từ ngô chuyển gen Bt11, để dựng đường chuẩn của gen đích, ADN tổng số của ngô chuyển gen Bt11 (100% Bt là mẫu chuẩn đã được chứng nhận hợp lệ) và ngô không chuyển gen được tách chiết và định lượng. Pha loãng ADN của Bt11 thành các mẫu (M1-M6) mang số bản sao bộ gen đơn bội khác nhau như sau: M1:20000; M2:5000; M3: 1250; M4: 312; M5: 78; và M6: 19 (được biết bộ gen đơn bội của ngô có khối lượng 2,725 pg). Trộn ADN của Bt11 đã pha loãng với ADN của ngô không chuyển gen để đảm bảo lượng ADN ở mỗi mẫu là bằng nhau. Để dựng đường chuẩn của gen tham chiếu - adh1, ADN tổng số của ngô không chuyển gen được tách chiết, định lượng và pha loãng thành các mẫu (S1-S6) mang số bản sao bộ gen đơn bội khác nhau như sau: S1: 183486; S2: 61162; S3: 20387; S4: 6796; S5: 2265; và S6:755 (được biết bộ gen đơn bội của ngô có khối lượng 2,725 pg).

Chi tiết xem thêm Thông tư 13/2013/TT-BTNMT, có hiệu lực từ 05/8/2013.    

Lê Vy

>> XEM BẢN TIẾNG ANH CỦA BÀI VIẾT NÀY TẠI ĐÂY