5.1.2 Dung dịch mồi

Dùng dung dịch đệm TE (5.1.3) để pha loãng mồi đến nồng độ 25 mM.

5.1.3 Dung dịch đệm TE (Tris - EDTA)

Chuẩn bị dung dịch chứa Tris [tris (hydroxymetyl) aminometan] 10 mM và EDTA 1 mM, dùng HCl để chỉnh pH 7,6.

5.2 Thuốc thử tách chiết RNA dùng hệ thống cột ly tâm

5.2.1 Dung dịch đệm ly giải

Chuẩn bị 25 ml dung dịch gồm: guanidin-HCl 4,5 M, natri phosphat 100 mM, pH 6,6. Bảo quản ở 25 ^oC.

5.2.2 Dung dịch đệm I (DNAaza I)

Chuẩn bị 500 µl dung dịch DNAaza I gồm enzym DNAaza 5 U/µl và dung dịch đệm rửa giải (5.2.6), trộn kỹ, bảo quản ở –15 ^oC đến –25 ^oC.

...

...

...

Chuẩn bị 10 ml dung dịch gồm NaCl 1 M, Tris-HCl 20 mM, MnCl₂ 10 mM, có pH 7,0. Bảo quản ở 25 ^oC.

5.2.4 Dung dịch đệm rửa I

Chuẩn bị 33 ml dung dịch gồm guanidin-HCl 5 M, Tris-HCl 20 mM, có pH 6,6. Thêm 20 ml etanol tinh khiết. Bảo quản ở 25 ^oC.

5.2.5 Dung dịch đệm rửa II

Chuẩn bị 10 ml dung dịch gồm NaCl 20 mM, Tris-HCl 2 mM, có pH 7,5. Thêm 40 ml etanol tinh khiết. Bảo quản ở 25 ^oC.

5.2.6 Dung dịch đệm rửa giải

Chuẩn bị 30 ml nước cất hai lần vô trùng và đã được khử enzym nucleaza.

CHÚ THÍCH Tách chiết RNA được thực hiện bởi nhiều phương pháp khác nhau, nhưng để đạt được kết quả mong muốn có thể sử dụng một số kit tách chiết RNA thương mại có bán sẵn. Nên sử dụng thuốc thử và các sản phẩm dùng cho phản ứng khuếch đại PCR được tổng hợp thành bộ chế phẩm đang được lưu hành trên thị trường có thành phần phù hợp như dưới đây.

5.3 Hỗn hợp phản ứng RT-PCR

...

...

...

Thành phần

25 µl/ống phản ứng

Nồng độ cuối

Nước thêm vào

6,5 µl

Dung dịch đệm EZ đậm đặc 5 lần

5,0 µl

1X

...

...

...

3,0 µl

300 µM mỗi loại

Mồi ngẫu nhiên pd (T)_12-18

1,0 µl

0,62 µM

Mồi 7171 F

1,0 µl

0,62 µM

Mồi 7511 R

...

...

...

0,62 µM

Mn(OAc)₂

2,5 µl

2,5 mM

Enzym rTth DNA polymeraza

1,0 µl

2,5 U

DNA đích

4,0 µl

...

...

...

5.4 Dung dịch đệm TBE đậm đặc 10 lần (Tris - axit boric - EDTA 10X)

Hòa tan 108 g Tris và 55 g axit boric trong 600 ml nước. Thêm 40 ml EDTA 0,5 M (5.5) và thêm nước cho đủ 1 l. Hấp vô trùng ở 121 ^oC trong 15 min. Bảo quản ở nhiệt độ phòng. Khi sử dụng, pha loãng dung dịch với nước thành dung dịch 1X.

5.5 Dung dịch EDTA (etylen diamin tetra axetic) 0,5 M

Hòa tan 93,05 g EDTA trong 350 ml nước, chỉnh pH 8,0 bằng dung dịch NaOH nồng độ 4 M. Thêm nước cho đủ 500 ml. Hấp vô trùng ở 121 ^oC trong 15 min. Bảo quản ở nhiệt độ phòng.

5.6 Dung dịch đệm tải mẫu DNA đậm đặc 6 lần

Chuẩn bị dung dịch gồm Tris-HCl 10 mM (pH 7,6); bromophenol blue 0,03 %; xylen xyanol FF 0,03 %; glycerol 60 % và EDTA 60 mM [sử dụng dung dịch EDTA 0,5 M (5.5)]. Bảo quản ở nhiệt độ –20 °C.

5.7 Dung dịch DEPC

Dung dịch di-etypyrocacbonat 0,1 % thể tích, lắc trộn đều khoảng 10 min. Sau đó để qua đêm trong bình kín, nới lỏng nắp và hấp khử trùng ở 121 °C trong 15 min. Bảo quản ở nhiệt độ –20 °C.

5.8 Thạch agaroza 1,5 %

...

...

...

5.9 Bảng thạch agaroza

Chuẩn bị khuôn, cân bằng mặt khuôn bằng giọt nước, gắn lược vào khuôn, đổ thạch agaroza (5.8) vào khuôn với bề dày từ 3 mm đến 5 mm. Để nguội và đông tự nhiên ở nhiệt độ phòng. Gỡ lược, đặt thạch agaroza vào trong máng điện di, các giếng của bảng thạch phải ở phía gần điện cực âm. Đổ dung dịch TBE 1X cho ngập mặt thạch agaroza trước khi cho sản phẩm khuếch đại vào để điện di.

5.10 Dung dịch etidi bromua (ethidium bromide)

Hút 5 µl dung dịch etidi bromua (10 mg/ml) hoà tan trong 100 ml nước. Bảo quản ở nhiệt độ không lớn hơn –20 °C.

5.11 Thang DNA

Sử dụng thang đo phù hợp có thể ước lượng được đoạn khuếch đại 341 bp. Có thể sử dụng sản phẩm khuếch đại có kích thước 341 bp đã biết trước.

6. Thiết bị và dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm vi sinh thông thường và cụ thể như sau:

6.1 Máy chu trình nhiệt, có thể thực hiện chính xác và lặp lại chu trình thời gian và nhiệt độ được quy định trong 7.4.5.

...

...

...

6.3 Máy ly tâm lạnh, có thể hoạt động với tốc độ tối đa trên 13 000 r/min.

6.4 Hệ thống phát hiện các sản phẩm PCR, bao gồm:

a) bộ điện di;

b) khuôn, khay, lược dùng để tạo bảng thạch agaroza;

c) bàn đọc kết quả, với tia UV bước sóng 302 nm;

d) bộ phận chụp ảnh để lưu kết quả, ví dụ: máy đọc Gel- Doc (nếu có).

6.5 Tủ đông, có thể hoạt động ở nhiệt độ không lớn hơn –20 ^oC.

6.6 Tủ lạnh, có thể hoạt động ở nhiệt độ từ 2 ^oC đến 8 ^oC.

6.7 Tủ thao tác vô trùng.

...

...

...

6.9 Micropipet, dung tích 10 µl, 20 µl, 100 µl và 1000 µl; có đầu típ (với dung tích không lớn hơn 10 µl phải sử dụng đầu típ có lọc).

6.10 Ống phản ứng, chuyên dùng cho PCR, dung tích 1,5 ml và 0,2 ml.

6.11 Ống lọc tinh, dạng ống nhựa có 2 lớp màng lọc polypropylen, để chứa dịch mẫu.

6.12 Ống góp, dùng bọc ngoài ống lọc tinh.

7. Cách tiến hành

7.1 Chuẩn bị mẫu

7.1.1 Đối với mẫu tôm hậu ấu trùng (postlarvae)

Lượng mẫu dùng cho mỗi phản ứng từ 10 cá thể đến 15 cá thể; lấy phần đuôi, không lấy gan tuỵ.

7.1.2 Đối với mẫu tôm bố mẹ

...

...

...

7.1.3 Đối với mẫu tôm thương phẩm

Lượng mẫu cần dùng cho mỗi phản ứng từ 100 mg đến 200 mg, lấy ở phiến mang tôm, hoặc chân bơi, chân bò hoặc phần cơ hoặc dịch bạch huyết của tôm khoảng 100 µl.

7.2 Tách chiết RNA dùng hệ thống cột ly tâm

Cho mẫu (7.1) vào các ống phản ứng dung tích 1,5 ml, thêm 400 µl dung dịch đệm ly giải (5.2.1), nghiền mẫu bằng chày nghiền vô trùng.

Ly tâm lạnh với tốc độ 13 000 r/min trong 2 min, nhằm loại bỏ mô chưa thủy phân.

Chuyển 200 µl phần dịch nổi sang các ống phản ứng dung tích 1,5 ml chứa 200 µl etanol tinh khiết, trộn đều.

Gắn ống lọc tinh (6.11) vào ống góp (6.12), chuyển toàn bộ dung dịch trên vào ống lọc tinh. Ly tâm lạnh với tốc độ 13 000 r/min trong 30 s. Loại bỏ phần nước chứa trong ống góp, gắn ống góp mới vào ống lọc tinh.

Thêm 90 µl dung dịch đệm ủ DNA polymeraza (5.2.3) và 10 µl dung dịch đệm DNA polymeraza I (5.2.2) vào ống lọc tinh, để 15 min ở nhiệt độ phòng.

Thêm 500 µl dung dịch đệm rửa I (5.2.4) vào ống lọc tinh, ly tâm với tốc độ 8 000 r/min trong 15 s, loại bỏ dịch trong ống góp.

...

...

...

Thêm 300 µl dung dịch đệm rửa II (5.2.5) vào ống lọc tinh, ly tâm với tốc độ 13 000 r/min trong 2 min, loại bỏ dịch trong ống góp. Ly tâm các ống góp chứa ống lọc tinh ở tốc độ cao nhất (có thể) trong 20 s để loại bỏ hoàn toàn dung dịch đệm rửa.

Gắn ống lọc tinh sang một ống phản ứng mới, dung tích 1,5 ml. Thêm 100 µl dung dịch đệm rửa giải (5.2.6) vào ống lọc tinh, ly tâm với tốc độ 8 000 r/min trong 1 min.

Loại bỏ ống lọc tinh, sản phẩm RNA được chứa trong ống phản ứng 1,5 ml. Dịch tách chiết RNA sử dụng ngay cho phản ứng khuếch đại hoặc bảo quản ở nhiệt độ –20 ^oC.

7.3 Chuẩn bị các kiểm chứng cho phản ứng RT-PCR

7.3.1 Mẫu kiểm soát

Nước cất hai lần hoặc dung dịch DEPC.

7.3.2 Mẫu kiểm chứng âm tính

Mẫu tôm không bị bệnh đã biết trước.

7.3.3 Mẫu kiểm chứng dương tính

...

...

...

7.4 Tổng hợp cDNA và khuếch đại cDNA một bước

7.4.1 Mẫu thử

Hút 5 µl dịch RNA của mẫu vào ống hỗn hợp phản ứng RT-PCR (5.3).

7.4.2 Mẫu kiểm soát

Hút 5 µl dung dịch nước cất hai lần hoặc dung dịch DEPC vào ống hỗn hợp phản ứng RT-PCR (5.3).

7.4.3 Mẫu kiểm chứng âm tính

Hút 5 µl dịch RNA của mẫu tôm đã biết trước không bị bệnh vào ống hỗn hợp phản ứng RT-PCR (5.3).

7.4.4 Mẫu kiểm chứng dương tính

Hút 5 µl dịch RNA của mẫu tôm nhiễm TSV đã biết trước hoặc plasmid của TSV vào ống hỗn hợp phản ứng RT-PCR (5.3).

...

...

...

7.4.5 Đặt các ống vào máy chu trình nhiệt để thực hiện phản ứng chuỗi trùng hợp - phiên mã ngược (RT-PCR) theo chu kỳ luân nhiệt như sau:

Số chu kỳ

Nhiệt độ, ^oC

Thời gian

Bước

1

42

15 min

Tổng hợp cDNA

...

...

...

2 min

Biến tính ban đầu

39

94

45 s

Biến tính

60

45 s

Lai/ bắt cặp

...

...

...

45 s

Kéo dài mạch

1

72

1 min

Kéo dài mạch

4

...

...

...

7.4.6 Giữ các sản phẩm khuếch đại ở 4,0 ⁰C cho đến khi điện di.

7.5 Điện di

7.5.1 Cho từ 5 µl đến 7 µl dung dịch đệm tải mẫu (5.6) vào các ống sản phẩm khuếch đại (7.4.6) trộn đều.

7.5.2 Hút từ 5 µl đến 7 µl dịch tương ứng từ các ống (7.5.1), theo thứ tự: thang DNA, các mẫu thử, mẫu kiểm chứng âm tính và mẫu kiểm chứng dương tính, nhỏ vào từng giếng trên bảng thạch agaroza (5.9).

7.5.3 Điện di với hiệu điện thế từ 70 V đến 120 V. Kiểm tra bằng cách quan sát các bóng khí nổi lên từ hai phía điện cực của máy điện di sau khi nối điện.

CHÚ THÍCH Dung dịch đệm tải mẫu gồm hai thành phần màu: màu xanh đậm của xanh bromophenol; màu xanh nhạt của xylen xyanol. Khi quan sát thấy màu xanh đậm của thuốc nhuộm cách giếng khoảng 2/3 chiều dài bảng thạch agaroza, dừng quá trình điện di. Sau đó, lấy thạch agaroza từ buồng điện di ra để nhuộm với etidi bromua.

7.5.4 Nhuộm etidi bromua: Đặt bảng thạch agaroza vừa điện di vào khay nhựa sạch, đổ dung dịch etidi bromua (5.10) ngập bảng thạch.

7.5.5 Lắc nhẹ trong khoảng 20 min. Vớt bảng thạch ra khỏi dung dịch nhuộm, rửa bằng nước cất trong 10 min để loại bỏ dung dịch nhuộm còn dư trên bề mặt bảng thạch.

7.5.6 Đặt bảng thạch trên bàn đọc kết quả với tia UV bước sóng 302 nm hoặc chụp hình ảnh bằng máy Gel- Doc (nếu có).

...

...

...

7.6.1 Dưới ánh sáng của tia UV, các đoạn cDNA có gắn etidi bromua phát quang tạo thành vạch sáng.

7.6.2 Đối chiếu các vạch sáng của mẫu với các vạch sáng từ thang DNA, mẫu kiểm chứng dương tính và mẫu kiểm chứng âm tính để đưa ra kết luận.

7.6.3 Cách đọc kết quả

Giếng

Vạch 341 bp

Kết quả

Thang DNA

Các vạch sáng rõ ràng

Điện di tốt

...

...

...

Không

Không ngoại nhiễm

Có

Bị ngoại nhiễm

Mẫu kiểm chứng dương tính

Có

Hỗn hợp phản ứng RT-PCR tốt

Không

Mẫu kiểm chứng dương tính hỏng hoặc enzym hỏng

...

...

...

Có

Dương tính với TSV

Không

Âm tính với TSV

8. Diễn giải kết quả

8.1 Kết quả âm tính với TSV

Kết quả được coi là âm tính khi:

a) mẫu thử không có vạch sáng kích thước 341 bp hoặc vạch sáng kích thước khác với mẫu kiểm chứng dương tính;

b) có vạch sáng của mẫu kiểm chứng dương tính;

...

...

...

d) thang DNA phân vạch rõ ràng theo kích thước sử dụng.

8.2 Kết quả dương tính với TSV

Kết quả được coi là dương tính khi:

a) mẫu thử có vạch sáng kích thước 341 bp;

b) có vạch sáng của mẫu kiểm chứng dương tính;

c) không có vạch sáng của mẫu kiểm chứng âm tính;

d) thang DNA phân vạch rõ ràng theo kích thước sử dụng.

9 Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

...

...

...

– phương pháp lấy mẫu đã sử dụng (nếu có);

– phương pháp thử sử dụng và viện dẫn tiêu chuẩn này;

– mọi thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc những điều kiện được coi là tự chọn và bất kỳ chi tiết nào có thể ảnh hưởng tới kết quả (nếu có);

– kết quả thử nghiệm thu được.