4.2. Hóa chất, môi trường nuôi cấy và dung dịch

Sử dụng nước cất hoặc nước khử ion có độ dẫn điện < 1 mS/cm.

Tất cả hóa chất phải là hóa chất phân tích và/hoặc phù hợp cho các mục đích vi sinh vật học.

4.2.1. Chất hoạt động bề mặt không ion

Sử dụng polyoxyetylen xobitan monooleat.

4.2.2. Nguyên vật liệu sinh học

Các nguyên vật liệu sinh học được yêu cầu gồm:

- Lecitin (lecitin);

- D-glucozơ (D-glucose);

...

...

...

- Cao thịt (meat extract), (xem Phụ lục A);

- Pepton (peptone), (xem Phụ lục A);

- Pepton cazein (casein peptone);

- Pepton đậu tương (soybean peptone);

- Trypton (tryptone).

4.2.3. Môi trường nuôi cấy

4.2.3.1. Quy định chung

Môi trường nuôi cấy qui định dưới đây sẽ được sử dụng. Môi trường này có thể nhận được từ các nhà cung cấp thương mại, khi sử dụng môi trường này phải theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

4.2.3.2. Môi trường huyền phù - 1/500 canh thang dinh dưỡng (1/500 NB)

...

...

...

4.2.3.3. Môi trường agar dinh dưỡng

Chuẩn bị môi trường agar dinh dưỡng bằng cách hòa tan 5,0 g cao thịt, 10,0g pepton, 5,0g NaCl và 15,0g bột agar trong 1000 mL nước cất hoặc nước khử ion. Vừa gia nhiệt vừa khuấy trên máy khuấy từ gia nhiệt hoặc bồn cách thủy cho đến khi bột agar tan hết. Điều chỉnh pH trong khoảng từ 7,0 đến 7,2 (ở 25⁰C) bằng dung dịch NaOH hay HCl. Khử trùng bằng nồi khử trùng (xem 6.2). Nếu chưa sử dụng ngay agar dinh dưỡng thì phải bảo quản ở nhiệt độ trong khoảng 5⁰C đến 10⁰C. Không được sử dụng agar dinh dưỡng đã lưu giữ quá một tháng.

4.2.3.4. Môi trường agar đĩa

Chuẩn bị môi trường agar đĩa bằng cách hòa tan 2,5g cao nấm men, 5,0 g trypton, 10,0g glucozơ và 15,0g bột agar trong 1000 mL nước cất hoặc nước khử ion. Vừa gia nhiệt vừa khuấy trên máy khuấy từ gia nhiệt hoặc trong bồn cách thủy cho đến khi agar tan hết. Điều chỉnh pH trong khoảng từ 7,0 đến 7,2 (ở 25⁰C) bằng dung dịch NaOH hay HCl. Khử trùng bằng nồi khử trùng (xem 6.2). Nếu không sử dụng ngay agar đĩa thì phải bảo quản ở nhiệt độ trong khoảng (5 ÷ 10)⁰C. Không được sử dụng agar đĩa đã lưu giữ quá một tháng.

4.2.3.5. Môi trường agar nghiêng

Rót từ 6 mL đến 10 mL agar dinh dưỡng đã được đun nóng chảy vào trong một ống nghiệm có nắp vặn. Khử trùng bằng nồi khử trùng (xem 6.2). Sau khi khử trùng, đặt ống nghiệm lên trên mặt nghiêng 15⁰ so với mặt phẳng nằm ngang, để agar đông. Nếu không sử dụng ngay môi trường agar nghiêng thì phải bảo quản ở nhiệt độ trong khoảng 5⁰C đến 10⁰C. Không được sử dụng môi trường agar nghiêng đã lưu giữ quá một tháng.

4.2.3.6. Canh thang cazein đậu tương với licitin và polyoxyetylen xobitan monooleat (Canh thang SCDLP)

Chuẩn bị canh thang SCDLP bằng cách hòa tan 17,0 g pepton cazein, 3,0g pepton đậu tương, 5,0g natri clorua (NaCl), 2,5g dinatri hydro photphat (Na₂HPO₄), 2,5 g glucozơ và 1,0 g lecitin trong 1000 mL nước cất hoặc nước khử ion. Khuấy đều rồi cho thêm 7,0 g chất hoạt động bề mặt không ion. Điều chỉnh pH trong khoảng từ 6,8 đến 7,2 (ở 25⁰C) bằng dung dịch NaOH hay HCl. Khử trùng bằng nồi khử trùng (xem 6.2). Nếu không sử dụng ngay canh thang SCDLP thì phải bảo quản ở nhiệt độ trong khoảng 5⁰C đến 10⁰C. Không được sử dụng canh thang SCDLP đã lưu giữ quá một tháng.

CHÚ THÍCH: SCDLP là môi trường trung tính đã xác định trong hầu hết các trường hợp. Thông tin về sự lựa chọn và đánh giá những tác nhân trung tính kháng khuẩn thay thế có thể xem thêm trong ASTM E 1054^[4] và EN 1040^[5].

...

...

...

Chuẩn bị dung dịch đệm photphat bằng cách cho 34,0 g kali dihydro photphat (KH₂PO₄) vào trong một bình tam giác dung tích 1000 mL. Thêm 500 mL nước cất hoặc nước khử ion vào bình và khuấy đều để hòa tan. Điều chỉnh pH trong khoảng từ 6,8 đến 7,2 (ở 25⁰C) bằng dung dịch NaOH. Thêm nước cất hoặc nước khử ion đến thể tích 1000 mL. Khử trùng bằng nồi khử trùng (xem 6.2). Không được sử dụng dung dịch đệm photphat đã lưu giữ quá một tháng.

4.2.3.8. Nước muối sinh lý đệm photphat

Chuẩn bị nước muối sinh lý bằng cách cho 8,5 g NaCl vào 1000 mL nước cất hoặc nước khử ion rồi khuấy đều để hòa tan. Pha loãng dung dịch đệm photphat đã điều chế tại 4.2.3.7 bằng nước muối sinh lý tới thể tích gấp 800 lần. Khử trùng dung dịch nước muối sinh lý đệm photphat bằng nồi khử trùng (xem 6.2). Nếu không sử dụng ngay dung dịch này thì phải bảo quản ở nhiệt độ trong khoảng 5⁰C đến 10⁰C, không được sử dụng khi đã lưu giữ quá một tháng.

5. Thiết bị dụng cụ

Trừ khi có quy định riêng khác, sử dụng các thiết bị, dụng cụ và vật liệu sau:

5.1. Thiết bị khử trùng khô, có khả năng duy trì nhiệt độ trong khoảng 160⁰C đến 180⁰C, độ chính xác ± 2⁰C.

5.2. Nồi khử trùng, có khả năng duy trì ở nhiệt độ (121 ± 2)⁰C và áp suất (103 ± 5) kPa.

5.3. Khuấy từ gia nhiệt hoặc bồn cách thủy

5.4. Máy đo pH, độ chính xác đến 0,2 đơn vị.

...

...

...

5.6. Pipet man vô khuẩn, có đầu 1000 mL.

5.7. Tủ nuôi cấy, có khả năng duy trì nhiệt độ thích hợp, chính xác đến ± 1⁰C.

5.8. Máy trộn siêu tốc, nếu yêu cầu (xem 7.6.1).

5.9. Máy siêu âm, nếu yêu cầu, (xem 7.6.1).

5.10. Các que cấy, đường kính trong 4 mm, vô khuẩn.

5.11. Màng mỏng, không ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của vi khuẩn hoặc hấp thụ nước (bằng polyetylen, polypropylen hay polyeste [poly(etylen terephatalat)]. Màng nên có độ dày từ 0,05 mm đến 0,10 mm.

CHÚ THÍCH: Có thể sử dụng màng mỏng được cắt ra từ các túi stomacher.

5.12. Các ống nghiệm có nắp xoắn

5.13. Đĩa Petri vô khuẩn; đường kính từ 90 mm đến 100 mm.

...

...

...

5.15. Bình cầu, dung tích 1000 mL.

5.16. Các bình tam giác (Erlenmeyer) nút nhám cổ hẹp hoặc các chai môi trường, cần để chuẩn bị môi trường.

6. Khử trùng thiết bị và bảo quản chủng giống gốc

6.1. Khử trùng khô

Đặt các dụng cụ, thiết bị cần được khử trùng trong thiết bị khử trùng khô, sử dụng thời gian tối thiểu ứng với từng nhiệt độ nêu sau đây:

Nhiệt độ

Thời gian khử trùng tối thiểu

180 ⁰C

30 min

...

...

...

60 min

160 ⁰C

120 min

6.2. Khử trùng hơi áp suất cao

Đặt các dụng cụ và thiết bị cần khử trùng vào trong một nồi khử trùng (autoclave) và duy trì ở nhiệt độ (121 ± 2)⁰C ít nhất 15 min.

6.3. Chuẩn bị dụng cụ thủy tinh

Rửa sạch bằng chất tẩy rửa trung tính hoặc kiềm, sau đó tráng sạch bằng nước cất hoặc nước khử ion. Khử trùng bằng thiết bị khử trùng khô hoặc trong nồi hấp trước khi dùng.

6.4. Duy trì các chủng giống gốc

Mẫu chủng giống gốc sẽ được lưu giữ ở nhiệt độ trong khoảng từ 5⁰C đến 10⁰C trong môi trường thích hợp và được cấy truyền mỗi tháng một lần. Sau năm lần cấy truyền hoặc sau một tháng giữa những lần cấy truyền chủng giống gốc sẽ bị loại bỏ và được thay thế bằng một giống mới, lấy từ viện nghiên cứu hoặc ngân hàng giống có liên quan.

...

...

...

7.1. Tiền nuôi cấy vi khuẩn

Dùng que cấy vô trùng, chuyển vi khuẩn từ ống giống gốc sang môi trường agar nghiêng (4.2.3.5) và ủ ở nhiệt độ (35 ± 1) ⁰C trong khoảng thời gian từ 16 h đến 24 h. Từ ống nghiệm này, dùng que cấy vô trùng cấy truyền vi khuẩn sang một ống môi trường agar nghiêng mới và ủ ở nhiệt độ (35 ± 1)⁰C trong khoảng thời gian từ 16 h đến 20 h.

7.2. Chuẩn bị các mẫu thử

Chuẩn bị mẫu thử sơn theo TCVN 2094:1993.

Thử nghiệm phải được thực hiện với ít nhất ba mẫu từ mỗi vật liệu thử nghiệm đã xử lý và sáu mẫu chưa xử lý. Nửa số mẫu chưa xử lý được dùng để đếm số lượng tế bào sống ngay sau nhiễm và nửa còn lại được dùng để đếm số tế bào sống sau 24 h nuôi cấy.

CHÚ THÍCH: Sử dụng lại hơn ba mẫu đối với vật liệu đã xử lý có thể giúp làm giảm sai số, đặc biệt là đối với những vật liệu có hiệu quả kháng khuẩn thấp hơn.

Khi kiểm tra một sêri các xử lý kháng khuẩn đối với một loại polyme thì mỗi xử lý kháng khuẩn có thể được so sánh với một bộ mẫu chưa xử lý duy nhất nếu tất cả các thí nghiệm được thực hiện cùng một lúc với cùng chủng kiểm định.

Chuẩn bị các mẫu thử phẳng đã xử lý và chưa xử lý có kích thước (50 ± 2) mm x (50 ± 2) mm, chiều dày không lớn hơn 10 mm. Nếu khó hoặc không có khả năng cắt mẫu thử theo kích thước trên thì có thể tạo mẫu có hình dạng và kích thước khác sao cho phủ được một lớp màng lên bề mặt có diện tích trong khoảng từ (400 ÷ 1600)mm². Chuẩn bị các mẫu thử từ sản phẩm cuối cùng là phù hợp nhất. Tuy nhiên, nếu hình dạng sản phẩm không phù hợp để tạo mẫu thử, thì có thể chuẩn bị mẫu thử với kiểu cách thích hợp cho quá trình thử nghiệm với các nguyên liệu ban đầu và các phương pháp thực hiện được dùng để sản xuất sản phẩm đó. Nếu mẫu thử có kích thước khác với (50 x 50) mm, thì kích thước thực tế phải được nêu trong báo cáo thử nghiệm.

Khi chuẩn bị các mẫu thử, cần tránh nhiễm vi sinh vật hoặc các chất bẩn hữu cơ ngoại lai. Tương tự, không được để các mẫu thử ở gần nhau. Nếu sử dụng các thiết bị kim loại, để tránh nhiễm chéo thì cần đảm bảo rằng kim loại đó không có tác dụng kháng khuẩn. Trong trường hợp cần thiết, các mẫu thử có thể được làm sạch/khử trùng trước khi thử nghiệm (ví dụ, lau bằng dung dịch 70% etanol trong nước).

...

...

...

7.3. Chuẩn bị vi khuẩn

Dùng một que cấy vô trùng, chuyển một vòng vi khuẩn kiểm định đã được chuẩn bị ở 7.1 vào một lượng nhỏ canh thang dinh dưỡng 1/500 NB đã chuẩn bị ở 4.2.3.2. Đảm bảo rằng vi khuẩn kiểm định phải được hòa tan đều, đếm số lượng vi khuẩn bằng phương pháp quan sát trực tiếp dưới kính hiển vi và buồng đếm hoặc bằng phương pháp thích hợp khác (ví dụ, đo mật độ quang học). Pha loãng dung dịch tế bào vi khuẩn trong môi trường 1/500 NB để đạt tới mật độ khoảng (2,5 ÷ 10)10⁵ tế bào/mL (nồng độ mong muốn là 6.10⁵ tế bào /mL). Sử dụng dung dịch này để nhiễm các mẫu thử. Nếu không sử dụng dung dịch này ngay thì phải giữ trong đá lạnh ở nhiệt độ 0⁰C và dùng nó trong vòng 2 h sau khi chuẩn bị.

7.4. Nhiễm vi khuẩn lên mẫu thử

Bề mặt sẽ được thử nghiệm là bề mặt ngoài của sản phẩm. Không thử các mặt cắt ngang của sản phẩm. Đặt từng mẫu thử đã chuẩn bị ở 7.2 vào từng đĩa petri vô trùng với bề mặt thử nghiệm quay lên trên. Lấy 0,4 mL vi khuẩn (đã chuẩn bị ở 7.3) nhỏ lên trên bề mặt mẫu thử. Dùng một màng mỏng (5.11) có kích thước (40 x 40) mm phủ lên và từ từ ấn nhẹ màng để dịch vi khuẩn dàn đều ra tới các cạnh. Phải đảm bảo sao cho dịch vi khuẩn không rỉ qua các cạnh của màng mỏng. Đậy nắp đĩa Petri lại (Hình 1).

Đơn vị tính bằng milimét

CHÚ DẪN

1 màng mỏng;

2 dịch vi khuẩn (0,4 mL);

...

...

...

4 đĩa Petri;

5 nắp đĩa Petri.

Hình 1 - Nhiễm vi khuẩn lên mẫu thử và phủ màng mỏng lên

Ngoại trừ những trường hợp qui định riêng khác, kích thước chuẩn của màng mỏng là (40 ± 2) mm x (40 ± 2) mm cho mẫu thử kích thước (50 x 50) mm. Nếu mẫu thử không đạt kích thước chuẩn, thì kích thước của màng sẽ thay đổi theo đúng tỉ lệ chuẩn đó. Tuy nhiên, không được giảm kích thước của màng xuống dưới 400 mm² và khoảng cách từ mép của màng đến mép của các mẫu thử phải là (2,5 ÷ 5,0) mm. Nếu kích thước màng mỏng khác (40 x 40) mm thì kích thước thực dùng sẽ được nêu trong báo cáo kết quả thử nghiệm. Thể tích dịch vi khuẩn đã dùng cũng được điều chỉnh tỉ lệ với diện tích màng sử dụng và được nêu trong báo cáo kết quả thử nghiệm.

Phải đảm bảo sao cho dịch vi khuẩn không bị rò rỉ ra ngoài cạnh của màng. Đối với một số bề mặt (ví dụ bề mặt rất hút nước) sẽ rất khó để tránh khỏi hiện tượng rò rỉ. Khi xuất hiện rò rỉ, sử dụng lựa chọn 1 sau đây. Nếu sự rò rỉ vẫn xuất hiện sau khi áp dụng lựa chọn 1, thì sử dụng lựa chọn 2. Nếu khi áp dụng một trong hai lựa chọn mà không xảy ra rò rỉ nữa thì sự lựa chọn đó phải được nêu trong báo cáo kết quả thử nghiệm.

- Lựa chọn 1: Giảm lượng dung dịch vi khuẩn nhỏ lên bề mặt mẫu thử. Tuy nhiên, không được giảm xuống mức dưới 0,1 mL. Khi giảm thể tích dung dịch nhiễm xuống, phải tăng nồng độ tế bào vi khuẩn trong dịch nhiễm lên để đảm bảo số lượng tế bào vi khuẩn nhiễm là không đổi.

- Lựa chọn 2: Tăng độ nhớt của dịch tập nhiễm bằng cách thêm chất làm đặc trơ như agar hoặc chất tương tự khác.

7.5. Ủ các mẫu thử đã nhiễm vi khuẩn

Ngoại trừ những trường hợp qui định riêng khác, ủ các đĩa Petri đựng các mẫu thử đã nhiễm vi khuẩn (gồm một nửa số mẫu thử chưa xử lý) ở nhiệt độ (35 ± 1) ⁰C và độ ẩm tương đối không nhỏ hơn 90% trong (24 ± 1) h. Hiệu quả kháng khuẩn của một sản phẩm được đánh giá dựa vào giá trị hoạt tính kháng khuẩn đạt được trong thí nghiệm ở nhiệt độ ủ xác định. Những nhiệt độ khác có thể được dùng nếu đạt được sự thỏa thuận của các bên liên quan. Nếu sử dụng nhiệt độ khác nhiệt độ (35 ± 1)⁰C, thì nhiệt độ đó phải được nêu trong báo cáo kết quả thử nghiệm.

...

...

...

7.6. Thu hồi vi khuẩn từ các mẫu thử

7.6.1. Xác định vi khuẩn trên các mẫu thử ngay sau khi nhiễm

Ngay sau khi nhiễm, tiến hành thu hồi một nửa số mẫu thử chưa xử lý bằng cách thêm 10 mL canh thang SCDLP (4.2.3.6) hoặc một loại thích hợp, cho chất trung hòa còn hạn sử dụng lên đĩa Petri chứa mẫu thử. Giá trị này sẽ được dùng để xác định tốc độ thu hồi vi khuẩn từ những mẫu thử thí nghiệm. Phải đảm bảo chất trung hòa rửa sạch hoàn toàn mẫu thử bằng cách dùng pipet để hút và nhả canh thang SCDLP ít nhất bốn lần.

Cần phải kiểm tra kỹ để có thể thu đủ lượng vi khuẩn, nhất là khi tiến hành với lựa chọn 2 trong 7. 4 và độ nhớt của dung dịch vi khuẩn tăng lên. Trong trường hợp này, khuấy cơ học có thể cần, như khuấy sâu, máy trộn siêu tốc, hay siêu âm. Nếu thấy tốc độ phục hồi là tương đương hoặc cao hơn so với phương pháp thực hiện ở trên thì sử dụng những phương pháp đó. Nếu sử dụng một phương pháp phục hồi khác, thì phương pháp đó sẽ được nêu trong báo cáo kết quả thử nghiệm. Có thể thu hồi vi khuẩn thử nghiệm bằng 10 ml chất trung hòa, do kích thước và đặc tính của mẫu thử thì có thể tăng thể tích của dung dịch sử dụng lên. Nếu thể tích của chất trung hòa được dùng không phải là 10 ml, thì thể tích thực đã dùng cần phải nêu trong báo cáo kết quả thử nghiệm và dùng nó để tính hiệu quả kháng khuẩn.

Các quá trình làm sạch khác có thể ảnh hưởng đến hoạt tính kháng khuẩn đo được và vì thế cần phải kiểm tra kỹ.

7.6.2. Kiểm tra các mẫu thử sau khi ủ

Sau khi ủ theo 7.5, thực hiện như 7.6.1 với các mẫu thử còn lại. Ngay sau đó, đếm số vi khuẩn sống đã thu hồi từ mẫu thử (xem 7.7).

7.7. Xác định lượng vi khuẩn sống bằng phương pháp đếm khuẩn lạc

Đếm các tế bào vi khuẩn sống bằng cách dùng một dãy dung dịch SCDLP pha loãng bậc 10 bằng nước muối sinh lý đệm photphat (4.2.3.8). Cho 1 mL mỗi lần pha loãng và 1 mL SCDLP thu hồi từ mẫu thử nghiệm vào các đĩa Petri vô khuẩn riêng biệt. Rót tiếp 15 mL agar đĩa (4.2.3.4) vào trong mỗi đĩa Petri và lắc khẽ cho hòa đều vi khuẩn. Mỗi đĩa được lặp lại hai lần. Lật ngược các đĩa Petri và ủ ở nhiệt độ (35 ± 1)⁰C trong (40 ÷ 48) h.

...

...

...

8. Biểu thị kết quả

8.1. Xác định số lượng vi khuẩn sống

Đối với mỗi mẫu thử, xác định số lượng vi khuẩn sống thu hồi theo công thức sau:

N = (100 x C x D x V)/A             (1)

Trong đó:

N là số lượng vi khuẩn sống thu hồi trên mỗi cm² mẫu thử;

C là số vi khuẩn trung bình của mỗi đĩa (trong số hai đĩa lặp lại);

D là hệ số pha loãng của đĩa được đếm;

V là thể tích của canh thang SCDLP đã cho vào mẫu, mL;

...

...

...

Tính giá trị trung bình số học của số lượng vi khuẩn sống thu hồi cho mỗi mẫu thử và biểu diễn giá trị đến hai chữ số có nghĩa. Nếu không có khuẩn lạc đếm được thu hồi trong bất kỳ agar đĩa nào đối với một sêri pha loãng, thì ghi số khuẩn lạc đã đếm là "< V" (với V là thể tích của SCDLP thêm vào mẫu, mL). Để tính giá trị trung bình khi không có vi khuẩn sống được thu hồi trong một sêri pha loãng thì coi như số lượng vi khuẩn sống là "V".

VÍ DỤ: Trong trường hợp V = 10 mL, số dùng để tính giá trị trung bình là 10.

8.2. Điều kiện thử nghiệm đúng

8.2.1. Khi ba điều kiện nêu trong 8.2.2, 8.2.3, và 8.2.4 được thỏa mãn thì phép thử sẽ được coi là đúng. Nếu tất cả các điều kiện không thỏa mãn, thì phép thử bị coi là sai và các mẫu phải được thử nghiệm lại.

8.2.2. Giá trị logarit của số vi khuẩn sống thu hồi ngay sau khi nhiễm từ các mẫu thử chưa xử lý phải thỏa mãn yêu cầu trong công thức sau:

(L_max - L_min)/(L_mean) ≤ 0,2               (2)

Trong đó:

L_max là logarit chung (logarit cơ số 10) của số vi khuẩn sống nhiều nhất được tìm thấy trên một mẫu thử;

L_min­ là logarit chung của số vi khuẩn còn sống nhỏ nhất được tìm thấy trên một mẫu thử;

...

...

...

8.2.3. Số lượng trung bình của vi khuẩn sống thu hồi ngay sau khi nhiễm của các mẫu thử chưa xử lý phải nằm trong khoảng (6,2 x 10³ đến 2,5 x 10⁴) tế bào/cm².

8.2.4. Số lượng vi khuẩn sống thu hồi từ mỗi mẫu thử chưa xử lý sau khi nuôi ủ trong 24 h phải không nhỏ hơn 6,2 x 10¹ tế bào/cm².

GHI CHÚ 6: Nếu nhiệt độ ủ nhỏ hơn 35⁰C được dùng trong 7.5, thì số lượng vi khuẩn sống thu hồi từ các mẫu thử chưa xử lý có thể không thỏa mãn tiêu chí này.

8.3. Tính giá trị hoạt tính kháng khuẩn

Khi phép thử là đúng thì giá trị hoạt tính kháng khuẩn sẽ được tính theo phương trình (3), kết quả được lấy chính xác đến một chữ số thập phân:

R = (U_t - U₀) - (A_t - U₀) = U_t - A_t                (3)

Trong đó:

R là giá trị hoạt tính kháng khuẩn;

U₀ là giá trị trung bình logarit chung của số vi khuẩn sống thu hồi từ các mẫu thử chưa xử lý ngay sau khi nhiễm, tế bào/cm²;

...

...

...

A_t là giá trị trung bình logarit chung của số vi khuẩn sống thu hồi từ các mẫu thử đã xử lý sau 24h, tế bào/cm².

8.4. Hoạt lực của chất kháng khuẩn

Giá trị hoạt tính kháng khuẩn được dùng để xác định hoạt lực của chất kháng khuẩn. Các giá trị hoạt tính kháng khuẩn dùng để xác định hoạt lực phải được tất cả các bên liên quan chấp nhận.

9. Độ lặp lại và độ tái lập

Độ lặp lại và độ tái lập được nêu trong Phụ lục B.

10. Báo cáo kết quả thử nghiệm

Báo cáo kết quả thử nghiệm phải bao gồm các thông tin sau đây:

a) Viện dẫn tiêu chuẩn này;

b) Loại mẫu sơn hoặc nhựa của các mẫu thử chưa xử lý và đã xử lý; kích thước, hình dạng và chiều dày của mẫu;

...

...

...

d) Loài vi khuẩn thử nghiệm được dùng và ký hiệu chủng, nêu lý do nếu dùng loài vi khuẩn khác;

e) Thể tích của giống vi khuẩn đã dùng;

f) Số lượng vi khuẩn sống trong giống vi khuẩn nhiễm;

g) Các giá trị U_0­, U_t và A_t dùng trong 8.3;

h) Hoạt tính kháng khuẩn tính được;

i) Chi tiết về bất kỳ sai lệch nào so với tiêu chuẩn này cũng như chi tiết bất kỳ quá trình thay thế nào khác nếu sử dụng, bao gồm: việc làm sạch các mẫu thử, sử dụng chất làm đặc trơ, loại và thể tích chất trung hòa đã dùng, việc sử dụng phương pháp thu hồi khác và nhiệt độ ủ khác.

j) Nêu rõ tên phòng thí nghiệm, tên và chữ ký của người đứng đầu phòng thí nghiệm;

k) Ngày tiến hành thí nghiệm;

l) Ngày xuất báo cáo kết quả thí nghiệm.

...

...

...

Phụ lục A

(Quy định)

Môi trường dinh dưỡng

A.1. Qui định chung

Chất lượng của các thành phần dùng trong các chế phẩm giống vi khuẩn có thể khác nhau tùy thuộc vào nguồn gốc và vì thế có thể gây ra sai số kết quả thí nghiệm. Do đó, thành phần của các chất sử dụng cần phải được xác định.

A.2. Thành phần hóa học của canh thang dinh dưỡng 1/500 (1/500 NB)

Cao thịt và pepton dùng cho vi khuẩn tập nhiễm 1/500 NB là những thành phần chính để giảm thiểu sai số. Tiếp đến là các yêu cầu về nitơ tổng số và nitơ amin đối với mọi vật liệu thương mại dùng cho tiêu chuẩn này. Pepton phải là một loại cazein được phân cắt bằng enzyme.

Cao thịt

Nitơ tổng số

...

...

...

Nitơ a - amin

từ 2,0% đến 5,0%.

Pepton (loại cazein phân cắt bằng enzyme)

Nitơ tổng số

từ 12,0% đến 16,0%;

Nitơ a - amin

từ 3,0% đến 6,0%.

Phụ lục B

...

...

...

Độ lặp lại và độ tái lập

B.1. Cơ sở thực hiện

Nội dung của phụ lục này dựa vào nghiên cứu trích dẫn từ nghiên cứu độ lặp lại và độ tái lập các kết quả thu được theo phương pháp này. Nghiên cứu này được thực hiện từ năm 2000 đến đầu năm 2004 của Viện công nghệ và đánh giá quốc gia Nhật Bản, một phần chấp thuận theo ISO/IEC 17025:2000^[13] như thành viên của Hệ thống công nhận phòng thí nghiệm quốc gia Nhật Bản (xem viện dẫn [3]) và một phần xác định những vấn đề chưa rõ của JIS Z 2801:2000^[1], là phương pháp cơ sở để xây dựng tiêu chuẩn này.

B.2. Tóm tắt

Độ lặp lại và độ tái lập của phương pháp này được xác định bằng phân tích thống kê phù hợp với ISO/IEC 17025:2000. Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn thu được từ năm phòng thí nghiệm ở Nhật Bản trên hai loại mẫu thử đã xử lý được lặp lại giống nhau hoàn toàn. Sau khi loại bỏ số liệu của một phòng thí nghiệm, phân tích số liệu còn lại đã cho những kết quả sau:

Độ lặp lại của các thử nghiệm xác định trong cùng một phòng thí nghiệm = 0,087;

Độ tái lập của các thử nghiệm xác định trong các phòng thí nghiệm khác nhau = 0,304.

Những số liệu trên là các ví dụ về độ lặp lại và độ tái lập có thể thu được theo phương pháp này, và không cần áp dụng để chấp nhận hoặc từ chối kết quả thử nghiệm của phòng thí nghiệm thu được với các thử nghiệm khác nhau.

B.3. Thí nghiệm

...

...

...

Bảng B.1 - Vật liệu và điều kiện thử

Các mẫu đã xử lý kháng khuẩn

Màng PET, kích thước (40 x 40 mm), dày 0,055 mm.

Mẫu loại I: màng sơn phủ acrylic có 350 mg/g hợp chất Ag.

Mẫu loại II: màng sơn phủ acrylic có 450 mg/g hợp chất Ag.

Các mẫu đối chứng chưa xử lý kháng khuẩn

Màng PET diện tích như trên nhưng không có Ag trong sơn acrylic

Màng mỏng

Màng PE, kích thước (50 x 50) mm, dày 0,09 mm

...

...

...

Staphylococcus aureus NBRC 12732 (xem chú thích 3)

Thể tích giống vi khuẩn

0,4 mL

Mỗi trong số năm phòng thí nghiệm tham gia việc thử nghiệm liên phòng thử nghiệm đã tiến hành các phép thử giống nhau hoàn toàn đối với hai loại mẫu đã xử lý. Số lượng mẫu sử dụng cho mỗi giai đoạn được qui định theo tiêu chuẩn này. Các mẫu cũng như vi khuẩn, môi trường,… được cung cấp cho các phòng thí nghiệm trước khi thử nghiệm.

CHÚ THÍCH 1: Mẫu gồm màng PET và màng sơn phủ acrylic tan trong nước. Một lượng chất kháng khuẩn xác định là hợp chất của bạc được phân tán trong dung dịch polyme acrylic trước khi phủ lên trên bề mặt PET. Việc phủ này phải đảm bảo lượng chất kháng khuẩn là đồng nhất trên các mẫu thử.

CHÚ THÍCH 2: Do màng sơn phủ acrylic tan trong nước, vi khuẩn tập nhiễm có xu hướng lan ra diện tích rộng hơn diện tích màng mỏng. Do đó, đã sử dụng một hệ mẫu/màng mỏng khác so với tiêu chuẩn này, đầu tiên màng mỏng được đặt vào, vi khuẩn được nhiễm đặt lên màng rồi mới đặt mẫu thử lên trên.

CHÚ THÍCH 3: Chỉ sử dụng Staphylococcus aureus do nó thể hiện độ sai số cao hơn E.coli.

B.4. Kết quả và thảo luận

Trong phân tích sơ bộ, điểm số Z được tính bằng cách phân tích biểu đồ lệch pha của một phòng thí nghiệm vượt quá 2,0. Vì thế, những kết quả từ phòng thí nghiệm đó đã bị loại bỏ và phân tích dữ liệu chỉ thực hiện với còn lại các kết quả thử nghiệm của bốn phòng thí nghiệm còn lại. Bảng B.2 biểu diễn hoạt tính kháng khuẩn trung bình và độ lệch chuẩn với mỗi loại mẫu đã xử lý kháng khuẩn. Các mẫu lặp lại nêu trong bảng có ký hiệu là "khối thứ nhất" và "khối thứ hai".

...

...

...

Loại mẫu

(xem Bảng B.1)

Hoạt tính kháng khuẩn trung bình

(với độ lệch chuẩn trong dấu ngoặc đơn)

Khối thứ nhất

Khối thứ hai

Mẫu loại I

1,72 (0,42)

1,78 (0,26)

...

...

...

2,29 (0,45)

2,42 (0,41)

Hai phép thử lặp lại được thực hiện ở mỗi phòng thí nghiệm trên mỗi trong số hai loại mẫu. Đối với mỗi loại mẫu sử dụng 3 mẫu thử. Các nguồn biến thiên được dùng để phân tích các kết quả gồm sự biến thiên giữa các phép thử lặp lại V_R (nghĩa là dù kết quả đó thu được từ khối thứ nhất hoặc khối thứ hai), phòng thí nghiệm thực hiện phép thử V_L và sự biến thiên giữa 3 mẫu đã được thử nghiệm V_S. Tuy nhiên, hệ số V_R và V_L không thể là ngẫu nhiên vì một phân tích độc lập được thực hiện trên mỗi block. Bảng B.3 nêu kết quả nhận được từ phân tích phương sai (ANOVA) và tính toán không đảm bảo.

Bảng B.3 - Bảng ANOVA và không đảm bảo

Nguồn biến thiên

Tổng diện tích

Bậc tự do

Diện tích m²

Tỉ lệ F

...

...

...

F (p = 0,01)

F (thử nghiệm)

Độ lặp, V_R

0,1200

1

0,1200

0,40

10,13

34,12

...

...

...

Phòng thí nghiệm, V_L

4,6569

3

1,5523

5,18

9,28

29,46

V_R x V_L (lỗi bậc nhất, e₁)

...

...

...

3

0,2297

13,84

2,90

4,46

^a

Mẫu thử V_s

4,4408

1

...

...

...

205,12

4,15

7,50

^a

V_L x V_S

0,3887

3

0,1296

5,98

...

...

...

4,46

^a

V_R x V_S

0,0133

1

0,0133

0,62

4,15

7,50

...

...

...

V_R x V_L x V_S

0,1160

3

0,0387

1,79

2,90

4,46

Lỗi bậc 2, e₂

...

...

...

32

0,0217

Tổng cộng

11,3277

47

...

...

...

^a Giá trị có nghĩa ở 1%

Như nêu trong Bảng B.3, lỗi điểm chính V_R x V_L (lỗi thứ nhất e₁) là cao hơn giá trị có nghĩa ở 1% so với lỗi thứ 2 e₂. Mặt khác, V_R x V_S và V_R x V_L x V_S không có tính thống kê so với e₂, vì vậy hiệu quả của hai lỗi này đã góp chung vào với lỗi phụ e₂'. Bảng B.4 nêu kết quả phân tích sự thay đổi sau khi gộp các phương sai không xác định.

Bảng B.4 - Bảng ANOVA và không đảm bảo (gộp các phương sai không xác định)

Nguồn thay đổi

Tổng diện tích

...

...

...

Trung bình m²

Tỉ lệ F

F (p=0,05)

F(p = 0,01)

F (thử nghiệm)

Độ lặp lại, V_R

0,1200

1

0,1200

...

...

...

10,13

34,12

Phòng thí nghiệm, V_L

4,6569

3

1,5523

5,18

9,28

...

...

...

V_R­ x V_­L­ (lỗi thứ nhất, e₁)

0,8991

3

0,2297

13,84

2,90

4,46

^a

...

...

...

4,4408

1

4,4408

194,46

4,11

7,50

^a

V_L x V_S

0,3887

...

...

...

0,1296

5,67

2,87

4,46

^a

Lỗi thứ 2, e₂'

0,8221

32

0,0228

...

...

...

Tổng cộng

11,3277

47

...

...

...

^a Giá trị có nghĩa ở 1%.

Những kết quả xác nhận V_R (sự thay đổi do lặp lại phép thử) và V_L (sự thay đổi do phòng thí nghiệm) là những kết quả độc lập không có tính thống kê.

Kết luận sau có thể rút ra từ những kết quả của nghiên cứu này:

- Độ lặp lại: sự không đảm bảo chuẩn ở các điều kiện lặp lại của ba lần đo lại có thể được tính từ các số liệu trên như sau:

s(e₂) = [V(e₂')/3]^1/2 = (0,0228/3)^1/2 = 0,087 (B.1)

- Độ tái lập: sự không đảm bảo chuẩn ở các điều kiện thực hiện lại có thể được tính từ các số liệu trên như sau:

s(e₁) = {[V(e_1­­) - V(e₂')]/3}^1/2 = [(0,2997 - 0,0228)/3]^1/2 = 0,304           (B.2)

...

...

...

[1] JIS Z 2801:2000, Antimicrobial products - Test for antimicrobial activity and efficacy (Các sản phẩm kháng vi sinh vật  - Thử nghiệm hiệu quả và hoạt tính kháng khuẩn).

[2] Suzuki, S., IMAI, S., and KOURAI, H. Background and evidence leading to the establishment of the JIS standard for antimicrobial product (Cơ sở và chứng cứ để thiết lập tiêu chuẩn JIS cho sản phẩm kháng vi sinh vật), Biocontrol Science, 19 (2006), pp. 135-145.

[3] Establishment of Traceability and Estimation of Uncertainty in Evaluation Methods using Bacteria (Tạo vết và tạm tính trong các phương pháp đánh giá sử dụng vi khuẩn), International Accreditation Japan/National Institute of Technology and Evaluation (IA Japan/NITE) report, March 2004.

[4] ASTM E 1054, Standard Test Methods for Evaluation of Inactivators of Antimicrobial Agents (Các phương pháp thử nghiệm chuẩn để đánh giá chất không hoạt động của những tác nhân kháng khuẩn).

[5] EN 1040, Chemical disinfectants and antiseptics - Quantitative suspension test for the evaluation of basic bactericidal activity of chemical disinfectants and antiseptics - Test method and requirements (Chất kháng khuẩn và khử trùng hóa học - Phép thử nhũ tương định lượng để đánh giá hoạt tính kháng vi khuẩn gốc của những chất kháng khuẩn và khử trùng hóa học - Phương pháp và yêu cầu thử nghiệm) (phase 1).

[6] ISO 846:1997, Plastics - Evaluation of the action of microorganisms (Nhựa - Đánh giá hoạt tính vi sinh vật).

[7] TCVN 4884:2005 (ISO 4833:2003) Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp định lượng vi sinh vật trên đĩa agar - Kỹ thuật đếm khuẩn lạc ở 30 ⁰C.

[8] TCVN 6910-2:2001 (ISO 5725-2:1994), Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo. Phần 2: Phương pháp cơ bản xác định độ lặp và độ tái lập của phương pháp đo tiêu chuẩn.

[9] TCVN 6507-1:2005 (ISO 6887-1) Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Chuẩn bị mẫu thử, huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng thập phân để kiểm tra vi sinh vật. Phần 1: Các nguyên tắc chung để chuẩn bị huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng thập phân.

...

...

...

[11] ISO 14852, Determination of the ultimate aerobic biodegradability of plastic materials in an aqueous medium - Method by analysis of evolved carbon dioxide (Xác định phân hủy sinh học hiếu khí tới hạn của vật liệu nhựa nhiệt dẻo trong môi trường nước - Phương pháp phân tích CO₂ thoát ra).

[12] ISO 14855 (both parts), Determination of the ultimate aerobic biodegradability of plastic materials under controlled composting conditions - Method by analysis of evolved carbon dioxide (Xác định phân hủy sinh học ưa khí tới hạn của vật liệu nhựa ở các điều kiện composting có kiểm soát - Phương pháp phân tích CO₂ thoát ra).

[13] TCVN ISO/IEC 17025:2001 (ISO/IEC 17025:2000) Yêu cầu chung về năng lực của phòng thử nghiệm và hiệu chuẩn.