Cặp mồi 4587F/4914R dùng để khuếch đại đoạn gen của vi rút IMNV có kích thước 328 bp. Cặp mồi 4725NF/4863NR dùng để khuếch đại đoạn gen có kích thước 139 bp.

Chuẩn bị mồi:

- Mồi ở trạng thái đông khô phải được ly tâm ngắn để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Lần đầu tiên nên dùng đệm TE để hoàn nguyên mồi ở nồng độ 200 pmol/l làm gốc.

- Mồi được sử dụng ở nồng độ 20 pmol/l: pha loãng mồi gốc bằng nước không có nuclease (10 l mồi gốc và 90 l nước).

3.2.1.5.2.2. Chuẩn bị phản ứng

Tùy theo điều kiện phòng thí nghiệm chọn lựa hỗn hợp Mix phản ứng thương mại phù hợp và sử dụng theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng RT-PCR bước một và bước hai theo số mẫu chẩn đoán, cộng thêm một mẫu đối chứng dương và một mẫu đối chứng âm, trộn chung vào một ống Eppendorf.

Sau đó hút 22,5 l hỗn hợp phản ứng vào ống Eppendorf 0,2 ml, ghi kí hiệu mẫu lên nắp ống Eppendorf, mẫu đối chứng dương và mẫu đối chứng âm.

3.2.1.5.2.3. Tiến hành phản ứng PCR bước 1

...

...

...

Hỗn hợp phản ứng RT-PCR bước 1, xem Bảng 2.

Bảng 2 - Hỗn hợp phản ứng RT-PCR bước 1

Thành phần

Thể tích cho 1 mẫu (25l), l

Nồng độ cuối cùng

Dung dịch đệm EZ (5X)

5

1 X

dNTP (10 mM mỗi loại)

...

...

...

300 M

rTth Enzyme (2,5 U/l)

1

0,1 U

Mồi 4587F

0,582 (20M)

0,465 M

Mồi 4914R

0,582 (20M)

...

...

...

Mn(OCOCH₃)₂ (25 mM)

2,5

2,5 mM

RNA mạch khuôn

2,5

Nước

12,086

...

...

...

Chu trình nhiệt của phản ứng RT-PCR bước 1 được nêu trong Bảng 3.

Bảng 3 - Chu trình nhiệt của phản ứng RT-PCR bước 1

Bước

Nhiệt độ/Thời gian

Số chu kỳ

Tạo cDNA

60 ^oC/30 min

1

Biến tính

...

...

...

1

Biến tính

95 ^oC/45 s

39

Bắt cặp

60 ^oC/45 s

Kéo dài mạch

60 ^oC/7 min

1

...

...

...

4 ^oC

Giữ ổn định

Sản phẩm khuếch đại bảo quản ở 4 ^oC cho đến khi điện di.

3.2.1.5.2.4. Tiến hành phản ứng RT-PCR bước 2

Thêm 0,5 l RNA mạch khuôn (sản phẩm PCR bước 1) vào ống PCR chứa sẵn 24,5 l hỗn hợp phản ứng RT-PCR (thành phần gồm: mỗi dNTP có nồng độ 200 M; magie clorua 1,5 mM và 2,5 U của Taq DNA polymerase, mỗi mồi 4725 NF, 4863 NR có nồng độ 0,465 M và nước cho đủ thể tích để được hỗn hợp PCR với tổng thể tích 25 l.

Có thể sử dụng thành phần hóa chất riêng lẻ hay sử dụng hỗn hợp phản ứng thương mại vẫn đảm bảo nồng độ cuối cùng của các thành phần trên.

Ví dụ về sử dụng hỗn hợp phản ứng RT-PCR bước 2, sử dụng hỗn hợp phản ứng Go Taq Green Master Mix của Promega 2 X, xem bảng 4.

Bảng 4 - Hỗn hợp phản ứng RT-PCR bước 2

Thành phần

...

...

...

Nồng độ cuối cùng

Promega Gotag Green Master Mix, 2X

12,5

1 X

Mồi 4725 NF

0,582 (20M)

0,465 M

Mồi 4863 NR

0,582 (20M)

...

...

...

Sản phẩm bước 1

0,5

Nước

10,836

Sau khi pha hỗn hợp cho mỗi phản ứng, đặt hỗn hợp vào máy luân nhiệt. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR bước 2 được nêu trong Bảng 5.

Bảng 5 - Chu trình nhiệt của phản ứng RT-PCR bước 2

Bước

...

...

...

Số chu kỳ

Biến tính

95 ^oC/2 min

1

Biến tính

95 ^oC/30 s

39

Bắt cặp

65 ^oC/30 s

...

...

...

72 ^oC/30 s

Kéo dài mạch

72 ^oC/2 min

1

Giữ ổn định

4 ^oC

Giữ ổn định

CHÚ Ý: Mẫu, nguyên liệu cho phản ứng RT-PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng.

CẢNH BÁO: Do bản chất của RNA là rất dễ bị phân hủy trong môi trường cũng như enzym RNAase tiết ra từ các vi sinh vật, môi trường chai, lọ, thiết bị, dụng cụ và dung dịch. Enzym RNAase rất bền, khó bị phân hủy bởi nhiệt độ. Vì vậy, tất cả mọi dụng cụ, thiết bị, thuốc thử dùng trong RT-PCR phải tuyệt đối vô trùng.

...

...

...

3.2.1.5.3.1. Chuẩn bị bản gel

Pha thạch nồng độ từ 1,5 % đến 2 % agarose bằng dung dịch đệm TBE 1X hoặc TAE 1X vào bình nón 250 ml, lắc cho tan.

Sau đó cho vào lò vi sóng đun đến sôi, đợi đến khi nhiệt độ giảm xuống khoảng 40 ^oC đến 50 ^oC, cho vào 5 l etidi bromua/100 ml. Lắc nhẹ tránh tạo bọt để etidi bromua tan đều.

Chuẩn bị khuôn đổ thạch, đặt lược vào khuôn, rồi đổ thạch vào khuôn.

Tiến hành đổ vào bản gel (chú ý không nên đổ bản gel dày quá 0,8 cm).

Khi bản gel đông lại thì tiến hành gỡ lược khỏi bản gel.

Chuyển bản gel vào máng điện di, đổ dung dịch đệm (TBE 1X hoặc TAE 1X) cùng loại với dung dịch đã đun agarose vào máng điện di cho tới khi ngập bản gel.

3.2.1.5.3.2. Điện di

Hút 10 l sản phẩm RT-PCR nhỏ vào một giếng trên bản gel.

...

...

...

Điện di ở hiệu điện thế 100 V đến 150 V (quan sát thấy bóng khí nổi lên từ hai phía điện cực của máy điện di sau khi nối điện). Khi quan sát thấy màu xanh đậm của thuốc nhuộm cách giếng khoảng 2/3 chiều dài bảng thạch agarose, dừng quá trình điện di.

CHÚ Ý: Trong trường hợp Master Mix không có sẵn đệm tải mẫu thì khi tiến hành điện di nhỏ 2 l. Loading dye 6X lên giấy parafin, hút 10 l sản phẩm PCR ra, nhỏ vào và trộn đều, sau đó lấy khoảng 10 l nhỏ vào một giếng trên bản gel.

3.2.1.5.4. Đọc kết quả

Sau khi điện di xong, đọc kết quả trên bàn đọc UV, đọc kết quả với tia UV bước sóng 302 nm.

Đối chiếu các vạch sáng của mẫu với các vạch sáng từ thang DNA, mẫu đối chứng dương tính và mẫu đối chứng âm tính để đưa ra kết luận.

Bảng 6 - Kết quả điện di

Giếng

Vạch 328 bp

Vạch 139 bp

...

...

...

Thang DNA

Phân vạch rõ ràng và sáng theo kích thước sử dụng

Điện di tốt

Mẫu đối chứng dương tính

Có

Có

Hỗn hợp phản ứng RT-PCR tốt

Không

Có

...

...

...

Không

Không

Mẫu đối chứng dương tính hỏng, enzym hỏng

Có

Không

Không đạt yêu cầu

Mẫu đối chứng âm tính

Không

Không

...

...

...

Có

Có

Bị ngoại nhiễm

Có

Không

Không

Có

Mẫu

Có

...

...

...

Dương tính IMNV

Không

Có

Dương tính với IMNV

Không

Không

Âm tính với IMNV

Có

Không

...

...

...

Kết quả mẫu thử dương tính khi xuất hiện vạch sáng có kích thước bằng kích thước giống mẫu đối chứng dương có kích thước 328 bp bước 1 và 139 bp bước 2 hoặc chỉ có vạch 139 bp bước 2. Thang DNA phân vạch rõ ràng, mẫu đối chứng âm không có vạch sáng.

Kết quả mẫu thử âm tính khi không có vạch sáng kích thước 139 bp. Không có vạch sáng của mẫu đối chứng âm tính, có vạch sáng mẫu đối chứng dương tính. Thang DNA phân vạch rõ ràng.

3.2.2. Phương pháp mô học

3.2.2.1. Thuốc thử và vật liệu thử

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích và sử dụng nước cất hai lần đã khử ion hoặc nước có độ tinh khiết tương đương không có RNAase, trừ khi có quy định khác.

- Dung dịch Davidson (xem A.1).

- Thuốc nhuộm hematoxylin (xem A.2).

- Thuốc nhuộm eosin (xem A.3).

- Etanol 70 %, 90 % và etanol tuyệt đối.

...

...

...

- Xylen.

- Keo dán, ví dụ Bom Canada.

3.2.2.2. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm chẩn đoán bệnh và cụ thể như sau:

- Kính giải phẫu.

- Bộ đồ giải phẫu gồm các dụng cụ panh, rùi nhọn, giải phẫu kéo các loại, lam kính và lamen.

- Lọ nhỏ cố định mẫu.

- Bình rót parafin.

- Bộ phận làm lạnh mẫu.

...

...

...

- Nồi nước có chỉnh nhiệt độ.

- Tủ ấm hoặc bàn sấy mẫu.

- Kính hiển vi quang học.

- Cassete.

- Khung đúc mẫu.

3.2.2.3. Lấy mẫu

Thu những mẫu tôm có dấu hiệu bệnh (như mô tả dấu hiệu bệnh lý phần trên).

Không dùng tôm chết hoặc tôm bảo quản đá để cắt mô.

3.2.2.4. Cách tiến hành

...

...

...

Cố định mẫu trong dung dịch Davidson. Đối với ấu trùng hoặc tôm hậu ấu trùng có thể cố định cả con trong dung dịch Davidson từ 12 h đến 24 h. Số tôm thu từ 30 con đến 50 con mỗi bể. Sau đó cố định trong etanol 70 % ở nhiệt độ phòng.

Đối với tôm lớn cố định bằng cách lấy tôm sống cắt lấy phần cơ đuôi, cơ bụng, sau đó cho vào lọ có chứa dung dịch Davidson. Số tôm thu từ 5 con đến 10 con một ao. Nếu mẫu lớn cần phải cắt nhỏ, chiều dài mẫu không quá 1 cm. Tỷ lệ mẫu và dung dịch cố định là 1/10, ngâm trong 24 h đến 72 h phụ thuộc vào kích thước của mẫu, sau đó bảo quản ngay trong etanol 70 % ở nhiệt độ phòng.

3.2.2.4.2. Khử mẫu cố định

Ngâm trong etanol 90 % hai lần, trong thời gian 30 min đến 60 min mỗi lần. Sau đó ngâm trong etanol tuyệt đối hai lần, thời gian 30 min đến 60 min mỗi lần.

3.2.2.4.3. Làm trong mẫu

Ngâm sang lọ xylen 1 để trong 30 min đến 60 min.

Ngâm sang lọ xylen 2 để trong 30 min đến 60 min.

Sau đó ngâm tẩm parafin hai lần, mỗi lần 56 ^oC đến 58 ^oC trong 1 h.

Đúc khuôn: Đặt mẫu đã thấm parafin vào khuôn đổ parafin tập trung vào một mặt của khuôn để khi cắt được tốt hơn. Làm lạnh mẫu trong bàn lạnh hoặc để trong tủ lạnh.

...

...

...

Cắt gọt khối block parafin vuông, mặt cắt bằng phẳng, để trên mặt khay đá.

Đặt mặt khối block parafin song song với mép lưỡi dao, cắt chiều dày lát cắt từ 4 m đến 5 m.

Chọn lát cắt tiêu bản phẳng thả vào nồi nước nhiệt độ nước từ 30 ^oC đến 35 ^oC; sau đó dùng lam kính vớt lát cắt tiêu bản. Để khô.

3.2.2.4.5. Nhuộm tiêu bản H&E

Tẩy parafin bằng cách ngâm trong xylen hai lần, mỗi lần từ 3 min đến 5 min, sau đó ngâm lần lượt trong etanol tuyệt đối, etanol 90 % và etanol 70 %, mỗi lần ngâm từ 3 min đến 5 min rồi đem rửa dưới vòi nước chảy từ 3 min đến 5 min.

Ngâm trong thuốc nhuộm haematoxylin từ 3 min đến 5 min sau đó rửa dưới vòi chảy từ 3 min đến 5 min rồi tiếp tục ngâm trong thuốc nhuộm eosin từ 1 min đến 2 min.

Làm mất nước trong mẫu qua các thang nồng độ etanol 75 %, etanol 90% và etanol tuyệt đối, mỗi bước từ 1 min đến 2 min, chuyển sang xylen hai lần (mỗi lần từ 2 min đến 3 min), gắn lamen bằng keo dán, ví dụ Bom Canada. Để khô và soi kính.

3.2.2.4.6. Đọc kết quả

Soi tiêu bản từ độ phóng đại thấp đến độ phóng đại cao (100 X, 400 X, 1000 X)

...

...

...

Tôm bị nhiễm nặng, phần cơ ở bụng bị hoại tử nghiêm trọng và sự xâm nhập với số lượng lớn của các tế bào máu vào vùng bị viêm.

3.2.3. Phương pháp lai tại chỗ (in situ hybridization - ISH)

3.2.3.1. Nguyên tắc

- Lai tại chỗ được phát triển từ phép lai Southern Blot.

Trình tự axit nucleic cần tìm không được tách chiết ra khỏi mô hay tế bào. Quá trình lai với mẫu dò đã được đánh dấu và phát hiện các phân tử lai được thực hiện ngay trên khuẩn lạc, nhiễm sắc thể, tế bào hay lát cắt mô.

3.2.3.2. Thuốc thử và vật liệu thử

- Dung dịch lai.

- Phosphatase kiềm và nitroblue tetrazolium và 5-bromo-4-chloro-3-indoyl phosphat.

Xem 3.2.2.1.

...

...

...

Xem 3.2.2.2.

3.2.3.4. Lấy mẫu

Thu những con tôm có dấu hiệu bị bệnh (như mô tả dấu hiệu bệnh lý phần trên).

Mẫu tôm dùng để phân tích phải còn sống hoặc đang còn trong tình trạng hấp hối.

3.2.3.5. Chuẩn bị mẫu

Để phát hiện IMNV thì mẫu tôm phải được cố định bằng cách cắt lấy phần cơ đuôi, cơ bụng ngâm trong dung dịch không axit [dung dịch R-F (A.4)].

Ngâm mẫu cố định từ 12 h đến 24 h, sau đó lấy mẫu ra khỏi dung dịch cố định, rửa với nước trong 1 h đến 2 h và đem xử lý mẫu.

3.2.3.6. Xử lý mẫu

Mẫu tôm cố định được xử lý và cố định trong parafin và cắt (4m) theo hướng dẫn trong quy trình chuẩn.

...

...

...

Cặp probe sử dụng trong quá trình lai, xem bảng 7.

Bảng 7 - Cặp probe sử dụng trong quá trình lai

Probe

Trình tự nucleotit

IMNV 993F

5'-AACACAAAATCTGCCAGCAA-3'

IMNV 993R

5'-CCCAACCACCCAAATTCATA-3'

Quy trình sử dụng cho phương pháp ISH được mô tả bởi Lightner (1996).

...

...

...

3.2.3.8. Đọc kết quả

Mẫu dương tính nếu có các thể vùi kết tủa màu xanh đến đen trong tế bào chất, những tế bào không bị nhiễm vi rút thì cấu trúc mô bình thường và bắt màu thuốc nhuộm bổ sung (màu cam).

Mẫu âm tính nếu không có màu xanh hoặc đen, chỉ bắt màu thuốc nhuộm bổ sung và có màu cam sau quá trình lai.

4. Báo cáo kết quả chẩn đoán

Tôm được xác định nhiễm bệnh IMNV khi có đặc điểm dịch tễ, triệu chứng lâm sàng của bệnh và kết quả dương tính trong các phương pháp sau:

- Phản ứng RT-PCR phát hiện vi rút dương tính;

- Mẫu cắt mô có bệnh tích của vi rút IMNV;

- Kết quả lai tại chỗ dương tính với IMNV.

...

...

...

(Quy định)

Thành phần và chuẩn bị dung dịch thuốc thử

A.1. Dung dịch Davidson

Etanol 95 %                                          330 ml

Formalin (formaldehyd 37 %)                 220 ml

Axit axetic đậm đặc                               115 ml

Nước                                                    335 ml

A.2. Thuốc nhuộm hematoxylin (dung dịch hematoxylin - Mayer)

Hematoxylin dạng tinh thể                      1 g

...

...

...

Amoni alum [NH₄Al(SO₄)₂] hoặc kali alum [KAl(SO₄)₂]: 50 g

Axit axetic                                             1 g

Cloral hydrat                                         50 g

Nước                                                    1000 ml

Hòa tan hematoxylin trong nước, sau đó cho natri iodat và amoni alum hoặc kali alum, hòa tan, tiếp tục cho axit axetic và chloral hydrat rồi lọc qua giấy lọc.

Bảo quản dung dịch đã pha trong chai tối màu.

A.3. Thuốc nhuộm eosin

Eosin Y                                                            1 g

Etanol 70 %                                          1 lít

...

...

...

Thêm từ 2 giọt đến 3 giọt axit axetic vào etanol 70 %. Hòa tan eosin trong etanol, sau đó cho thêm axit axetic rồi lọc qua giấy lọc.

Bảo quản dung dịch đã pha trong chai tối màu.

A.4. Dung dịch R-F (RNA - friendly)

Formaldehyd 37 %                                349 ml

Cồn 95 %                                              407 ml

Nước                                                    244 ml

Chỉnh pH = 7.

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

...

...

...

[2] Manual of Diagnostic Test for Aquatic Animals, 2010. Viral encephalopathy and retinopathy.

[3] Manual of Diagnostic Test for Aquatic Animals, 2009. Infectious myonecrosis.

[4] Tang et al. 2005. K.F.J. Tang, C.R. Pantoja, B.T. Poulos, R.M. Redman and D.V. Lightner. In situ hybridization demonstrates that Litopenaeus vannamei, L. stylirostris and Penaeus monodon are susceptible to experimental infection with infectious myonecrosis virus (IMNV), Dis. Aquat. Org. 63, pp. 261-265.