Chuẩn bị mồi:

- Mồi ở trạng thái đông khô phải được ly tâm ngắn để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Lần đầu tiên nên dùng đệm TE để hoàn nguyên mồi ở nồng độ 200 pmol/ml làm gốc.

- Mồi được sử dụng ở nồng độ 20 pmol/ml: pha loãng mồi gốc bằng nước không có nuclease (10 ml mồi gốc và 90 ml nước).

3.2.5.2.2. Chuẩn bị phản ứng

Tùy theo điều kiện phòng thí nghiệm chọn lựa hỗn hợp Mix phản ứng cho phù hợp và sử dụng theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Hỗn hợp phản ứng giai đoạn phiên mã ngược, bước 1 và bước 2 được chuẩn bị trong 1 ống Eppendorf dựa trên tổng số mẫu cần chẩn đoán, cộng thêm một mẫu đối chứng dương và một mẫu đối chứng âm, trộn chung vào một ống Eppendorf.

3.2.5.2.3. Tiến hành phản ứng RT-PCR bước 1

Giai đoạn phiên mã ngược (tạo cDNA)

Giai đoạn phiên mã ngược được thực hiện trong 1 h ở 37 °C. Thể tích hỗn hợp phản ứng 20 ml có thành phần dung dịch đệm như sau: 1 X dung dịch M-MLV RT buffer hai bước (Two-Step MMLV RT-PCR Kit) bao gồm (Tris 50 mM, pH 8,3, KCl 75 mM, KCl 10 mM, DTT 10 mM, MgCl₂ 3 mM) và mỗi dNTP có nồng độ 1 mM, mồi R2 có nồng độ 1 mM, 20 đơn vị enzym M-MLV reverse transcriptase và 2,5 ml RNA mạch khuôn được tách chiết ở trên.

...

...

...

Bảng 2 - Hỗn hợp phản ứng giai đoạn phiên mã ngược sử dụng kit Two-Step MMLV RT-PCR

Thành phần

Thể tích cho 1 mẫu, ml

Nồng độ cuối cùng

10X First Strand Buffer

                      2                     

1X

MMLV RT (100 U/ml)

0,2

...

...

...

Mồi R2 (20 mM)

5

5 mM

dNTP (12,5 mM)

1,6

1 mM

RNA mạch khuôn

2,5

...

...

...

8,7

Sản phẩm cDNA tổng hợp được sử dụng cho phản ứng RT-PCR.

Phản ứng RT-PCR (bước 1)

Hỗn hợp phản ứng RT-PCR: hỗn hợp dung dịch đệm RT-PCR bao gồm (KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 9,0 và Triton X-100 0,1%); MgCl₂ 2,5 mM, mỗi dNTP có nồng độ 200 mM, 20 pmol mồi R2, F1 có nồng độ 1 mM, 0,625 U Taq DNA polymerase, 2,5 ml sản phẩm cDNA ở trên và nước sao cho đủ thể tích 25 ml hỗn hợp phản ứng.

Có thể sử dụng thành phần thuốc thử riêng lẻ hay sử dụng hỗn hợp phản ứng thương mại sao cho đảm bảo nồng độ cuối cùng của các thành phần như trên, ví dụ sử dụng hỗn hợp phản ứng Go Taq Green Master Mix của Promega, 2X có thành phần 2X green Go Taq Reaction Buffer (pH 8,5); dNTP 400 mM; MgCl₂ 3 mM; Taq DNA polymerase, và chất đệm tải mẫu (yellow dye và blue dye) nên khi chạy gel không cần thêm chất đệm tải mẫu (loading dye).

Ví dụ về hỗn hợp phản ứng RT-PCR bước 1, sử dụng hỗn hợp phản ứng Go Taq Green Master Mix của Promega, 2X như trong Bảng 3.

Bảng 3 - Ví dụ hỗn hợp phản ứng RT-PCR bước 1

Thành phần

...

...

...

Nồng độ cuối cùng

Promega Gotag Green Master Mix, 2X

12.5

1 X

Mồi F1 (20 mM)

1,25

1 mM

Mồi R2 (20 mM)

1,25

...

...

...

Nước

7,5

Sản phẩm cDNA

2.5

Sau khi pha hỗn hợp cho mỗi phản ứng đặt vào máy luân nhiệt.

Chu trình nhiệt của phản ứng PCR bước 1 được nêu trong Bảng 4.

Bảng 4 - Chu trình nhiệt của phản ứng RT-PCR bước 1

...

...

...

Nhiệt độ/thời gian

Số chu kỳ

Biến tính

95^oC/1 min

30

Bắt cặp

55^oC/1 min

Tổng hợp

72^oC/1 min

...

...

...

72^oC/10 min

Giữ ổn định

4^oC

Giữ ổn định

3.2.5.2.4. Tiến hành phản ứng RT-PCR bước 2

Thêm 2,5 ml mạch khuôn (sản phẩm bước 1) vào ống PCT chứa sẵn 22,5 ml hỗn hợp phản ứng thành phần gồm như sau: 1 x PCR (KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 9 và Triton X-100 nồng độ 0,1 %); MgCl₂ 2,5 mM, mỗi dNTP có nồng độ 200 mM, mỗi R4 nồng độ 1 mM, mồi F1 nồng độ 1 mM 0,625 U Taq DNA polymerase) để được hỗn hợp PCR với tổng thể tích 25 ml.

Có thể sử dụng thành phần hóa chất riêng lẻ hay sử dụng hỗn hợp phản ứng thương mại vẫn đảm bảo nồng độ cuối cùng của các thành phần như trên sử dụng cặp mồi SVC R2 và SVC F1. Ví dụ hỗn hợp phản ứng sử dụng hỗn hợp phản ứng Go Taq Green Master Mix của Promega, 2X có thành phần 2X green Go Taq Reaction Buffer (pH 8,5); 400 mM mỗi dNTP; MgCl₂ 3 mM, Taq DNA polymerase và chất đệm tải mẫu (yellow dye và blue dye) nên khi chạy gel không cần thêm chất đệm tải mẫu (loading dye).

Ví dụ về hỗn hợp phản ứng bước 2, sử dụng hỗn hợp phản ứng Go Taq Green Master Mix của Promega 2X như trong Bảng 5.

...

...

...

Thành phần

Thể tích cho 1 mẫu, ml

Nồng độ cuối cùng

Promega Go Taq Green Master Mix, 2X

12,5

1 X

Mồi R4 (20 mM)

1,25

1 mM

...

...

...

1,25

1 mM

Sản phẩm PCR bước 1

2,5

Nước

7,5

Sau khi pha hỗn hợp cho mỗi phản ứng đặt vào máy luân nhiệt. Chu trình nhiệt của phản ứng RT-PCR bước 2 được nêu trong Bảng 6.

...

...

...

Bước

Nhiệt độ/thời gian

Số chu kỳ

Biến tính

95^oC/1 min

30

Bắt cặp

55^oC/1 min

Tổng hợp

...

...

...

Kéo dài mạch

72^oC/10 min

Giữ ổn định

4^oC

Giữ ổn định

CHÚ Ý: Mẫu và nguyên liệu cho phản ứng RT-PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng.

CẢNH BÁO: Do bản chất của RNA là rất dễ bị phân hủy trong môi trường cũng như enzym RNAase tiết ra từ các vi sinh vật, môi trường chai, lọ, thiết bị, dụng cụ và dung dịch. Enzym RNAase rất bền, khó bị phân hủy bởi nhiệt độ. Vì vậy, tất cả mọi dụng cụ, thiết bị, thuốc thử dùng trong RT-PCR phải tuyệt đối vô trùng.

3.2.5.3. Chạy điện di

...

...

...

Pha thạch nồng độ từ 1,5% đến 2% agarose bằng dung dịch đệm TBE 1X hoặc TAE 1X vào bình nón 250 ml, lắc cho tan.

Sau đó cho vào lò vi sóng đun đến sôi, đợi đến khi nhiệt độ giảm xuống khoảng 40°C đến 50°C, cho vào 5 ml etidi bromua/100 ml. Lắc nhẹ tránh tạo bọt để etidi bromua tan đều.

Chuẩn bị khuôn đổ thạch, đặt lược vào khuôn, rồi đổ thạch vào khuôn.

Tiến hành đổ vào bản gel (chú ý không nên đổ bản gel dày quá 0,8 cm).

Khi bản gel đông lại thì tiến hành gỡ lược khỏi bản gel.

Chuyển bản gel vào máng điện di, đổ dung dịch đệm (TBE 1X hoặc TAE 1X) cùng loại với dung dịch đã đun agarose) vào máng điện di cho tới khi ngập bản gel.

3.2.5.3.2. Điện di

Hút 10 ml sản phẩm RT-PCR nhỏ vào một giếng trên bản gel.

Khi thực hiện điện di, chạy kèm theo DNA marker để dự đoán kích thước sản phẩm khuếch đại. Hút 10 ml thang DNA vào một giếng trên bản gel.

...

...

...

CHÚ Ý: Trong trường hợp Master Mix không có sẵn đệm tải mẫu thì khi tiến hành điện di nhỏ 2 ml đệm tải mẫu 6X lên giấy parafin, hút 10 ml sản phẩm PCR ra, nhỏ vào và trộn đều, sau đó lấy khoảng 10 ml nhỏ vào một giếng trên bản gel.

3.2.5.4. Đọc kết quả

Sau khi điện di xong, đọc kết quả trên bàn đọc UV, đọc kết quả với tia UV bước sóng 302 nm.

Đối chiếu các vạch sáng của mẫu với các vạch sáng từ thang DNA, mẫu đối chứng dương tính và mẫu đối chứng âm tính để đưa ra kết luận.

Bảng 7 - Kết quả điện di

Giếng

Vạch 714 bp

Vạch 606 bp

Kết quả

...

...

...

Phân vạch rõ ràng và sáng theo kích thước sử dụng

Điện di tốt

Mẫu đối chứng dương

Có

Có

Hỗn hợp phản ứng RT-PCR tốt

Không

Có

Đạt yêu cầu

...

...

...

Không

Mẫu đối chứng dương tính hỏng, enzym hỏng

Có

Không

Không đạt yêu cầu

Mẫu đối chứng âm tính

Không

Không

Không ngoại nhiễm

...

...

...

Có

Bị ngoại nhiễm

Có

Không

Không

Có

Mẫu

Có

Có

...

...

...

Không

Có

Dương tính với SVC

Không

Không

Âm tính với SVC

Có

Không

Không chấp nhận kết quả. Phân tích lại mẫu

...

...

...

Kết quả mẫu thử âm tính khi: Không có vạch sáng kích thước 606 bp. Không có vạch sáng của mẫu đối chứng âm tính, có vạch sáng mẫu đối chứng dương tính. Thang DNA phân vạch rõ ràng.

4. Báo cáo kết quả chẩn đoán

Cá được xác định bị nhiễm bệnh SVC khi có đặc điểm dịch tễ, triệu chứng lâm sàng của bệnh và kết quả phản ứng RT-PCR phát hiện vi rút dương tính.

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Alikin Y.S., Shchelkunov I.S., Shchelkunova T.I., Kupinskaya O.A., Masycheva V.I., Klimenko V.P, & Fadina V.A. 1996, Prophylactic treatment of viral diseases in fish using native RNA linked to soluble and corpuscular carriers. J.Fish Biol., 49, 195-205.

[2] Bùi Quang Tề và cộng sự. 2008., Bệnh học thủy sản.

[3] Manual of Diagnostic Test for Aquatic Animals. 2010.

[4] Magdy K.Soliman, Mohammed M. Aboeisa, Safinaz G. Mohamed, Walid D. Saleh. 2008. First record of isolation and identification of Spring of carp virus from Oreochromis niloticus in Egypt. 1294-1300.

...

...

...

[6] Békési I. & Csontos L. (1985). Isolation of spring viraemia of carp virus from asymptomatic broodstock carp, Cyprinus carpio L. J.Fish Dis., 8, 471-472