CHÚ THÍCH Có thể sử dụng cột ngắn hơn (ví dụ cột có chiều dài 120 mm đến 150 mm).

5.15. Lọ, khoảng 5 ml có nắp vặn PTFE, hoặc bình chứa có nắp hàn kín thích hợp.

5.16. Xyranh thể tích xác định.

6. Cách tiến hành

6.1. Khái quát

Toàn bộ qui trình phân tích cần được thực hiện trong ngày. Nếu cùng một lúc chuẩn bị vài mẫu thì tất cả các mẫu cần được phân tích cùng một thời điểm trong suốt cả đêm bằng cách sử dụng bộ bơm mẫu tự động.

6.2. Chuẩn bị mẫu thử

Dùng máy nghiền phòng thử nghiệm (5.1) để nghiền mẫu thử và trộn kỹ cho đến khi lọt hết qua sàng 1 mm (5.1) hoặc dùng máy trộn để trộn kỹ.

6.3. Chiết ocratoxin A ra khỏi mẫu

...

...

...

6.4. Tách

Chuyển 50 ml dịch lọc sang phễu chiết 100 ml (5.8). Cho thêm 10 ml dung dịch natri bicacbonat (4.4) và lắc nhẹ. Để yên tách pha. Nếu hình thành nhũ tương, thì ly tâm trong 2 phút ở tốc độ 2000 vòng/phút. Thu lấy pha lỏng phía trên để chiết cột.

6.5. Chuẩn bị cột

Gắn cột (5.10) vào bộ hút chân không nhiều cổng (5.11) với bình nón 25 ml hoặc cốc bên trong bộ hút chân không để thu lấy các dung môi rửa và ổn định. Rửa mỗi cột 2 lần bằng 2 ml metanol (4.7), 2 ml nước và 2 ml dung dịch natri bicacbonat (4.4). KHÔNG ĐỂ CỘT CHẢY ĐẾN KHÔ. Hút nhẹ để tăng tốc độ rửa giải. Quy trình này cũng có thể thực hiện bằng tay bằng cách tạo áp lực bởi xyranh 5 ml đến 10 ml được đặt cố định trên đỉnh cột. Để lại khoảng 2 mm dung môi trên đỉnh cột (frít).

6.6. Chiết cột

Dùng pipet lấy 5 ml dịch chiết bicacbonat thu được trong 6.4 cho vào cột C₁₈, KHÔNG ĐỂ CỘT CHẢY ĐẾN KHÔ. Rửa bằng 2 ml dung dịch axit phosphoric (4.2) sau đó bằng 2 ml nước. Loại bỏ nước rửa.

Rửa giải ocratoxin A bằng 8 ml dung dịch rửa giải (4.11). Thu lấy dịch rửa giải vào ống nghiệm 10 ml (5.12) có chứa 2 ml nước. Lắc hoặc khuấy dịch rửa giải bằng đũa thủy tinh để trộn hai pha với nhau. Dùng pipet lấy dịch rửa đã chiết ocratoxin A (pha trên) cho vào một ống nghiệm 10 ml khác có nắp vặn (5.12). Tráng pha phía trên còn lại ra khỏi ống thứ nhất hai lần bằng 1 ml etyl axetat (4.5) và cho vào pha ocratoxin A trong ống thứ hai. Cho bay hơi đến vừa khô dưới dòng nitơ. Hòa tan ngay vào 500 ml (V_T) của pha động (4.12) và lọc qua bộ lọc 0,45 mm (5.13) cho vào lọ nhỏ có nắp vặn 5 ml (= dung dịch mẫu thử).

Giữ dung dịch mẫu thử còn lại để khẳng định nhận biết qua sự hình thành metyl este (xem 6.11)

6.7. Các điều kiện vận hành HPLC

...

...

...

Tốc độ dòng:

1 ml/phút

Phát hiện huỳnh quang [có cách tử (grating)]:

Bước sóng kích thích: 333 nm

Bước sóng phát xạ: 460 nm

Phát hiện huỳnh quang (có bộ lọc):

420 nm

Thể tích bơm (V_i)

...

...

...

6.8. Đường chuẩn

Chuẩn bị đường chuẩn ngay từ khi bắt đầu phân tích và bất cứ khi nào thay đổi các điều kiện.

Bơm ít nhất bốn dung dịch hiệu chuẩn có các nồng độ thích hợp khác nhau (4.19).

Vẽ đồ thị các giá trị huỳnh quang của các dung dịch hiệu chuẩn ocratoxin A dựa theo các nồng độ khối lượng ocratoxin A, tính bằng nanogam.

Cần kiểm tra độ tuyến tính [9].

6.9. Nhận biết

Nhận biết ocratoxin A bằng cách so sánh thời gian lưu của mẫu với thời gian lưu của chất chuẩn.

Đôi khi có thể cần phải nhận biết pic của ocratoxin A bằng cách bơm đồng thời dung dịch mẫu thử và dung dịch chuẩn.

6.10. Xác định

...

...

...

Bơm các thể tích bằng nhau của dung dịch mẫu thử và dung dịch chuẩn dùng cho đường chuẩn.

Đọc khối lượng ocratoxin A, tính bằng nanogam, tương ứng với huỳnh quang của dung dịch mẫu thử từ đường chuẩn.

Nếu hàm lượng ocratoxin A của mẫu nằm ngoài đường chuẩn, thì điều chỉnh lượng mẫu bơm bằng cách cô đặc hoặc pha loãng dung dịch mẫu thử.

6.11. Khẳng định

Nếu cần khẳng định việc nhận biết, thì bằng cách làm biến mất pic tại thời gian lưu đối với ocratoxin A và cho xuất hiện lại pic mới tại cùng thời gian lưu như thời gian lưu của este metyl chuẩn của ocratoxin A (sau khoảng 15 phút).

Chuyển lượng dung dịch mẫu thử còn lại (xem 6.6) vào phễu chiết 25 ml (5.8), tráng ba lần, mỗi lần 1 ml diclorometan (4.10) để tráng lọ. Lắc và để yên cho tách lớp. Thu lấy lớp phía dưới cho vào lọ nhỏ (5.15) và để cho bay hơi đến khô.

Chuyển 100 ml dịch ocratoxin A chuẩn (4.18) vào lọ nhỏ khác (5.15) và cho bay hơi đến khô.

Cho 0,5 ml dung dịch bo triflorua metanol (4.15) vào mỗi lọ nhỏ, đậy nắp và làm nóng 15 phút trên nồi cách thủy ở 50^oC đến 60^oC. Cho bay hơi đến khô trên nồi hơi dưới dòng khí nitơ.

Nếu có mặt của nước thì thêm 1 ml axetonitril (4.9) và tiếp tục cho bay hơi đến khô. Làm nguội và pha loãng bằng pha động (4.12) đến cùng thể tích giống như dùng cho phân tích HPLC của dung dịch mẫu thử chưa dẫn xuất (xem 6.7.3) và dung dịch này được dùng để tách sắc ký trong các điều kiện như mô tả trong 6.7.

...

...

...

7. Tính toán

Tính phần khối lượng w_OTA của ocratoxin A bằng microgam trên kilogam, sử dụng công thức (2) (phương pháp ngoại chuẩn):

                  (2)

Trong đó

m là số đo của phần mẫu thử trong dịch chiết cuối cùng, ở đây: 50 g x 50 ml x 5 ml/250 ml x 10 ml = 5 g;

R_S là số đo của dung dịch mẫu thử đã tiêm được đo theo diện tích pic hoặc chiều cao pic.

R_A là số đo (số đo đối với 1 ng ocratoxin A) chuẩn hóa trung bình tính được của năm dung dịch hiệu chuẩn khác nhau;

V_T là thể tích cuối cùng của dung dịch mẫu thử (trong trường hợp này là 500 ml);

V₁ là thể tích của mẫu thử đã bơm (trong trường hợp này là 25 ml).

...

...

...

Nêu rõ việc thực hiện chỉnh sửa hay không chỉnh sửa hệ số thu hồi.

8. Độ chụm

8.1. Yêu cầu chung

Các chi tiết về phép thử liên phòng thí nghiệm về độ chụm của phương pháp theo ISO 5725:1986 [1] được đưa ra trong phụ lục A. Các giá trị thu được từ phép thử liên phòng này có thể không áp dụng được cho các dải nồng độ của mẫu cần phân tích và các chất nền khác với phụ lục A.

8.2. Độ lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm đơn lẻ thực hiện trên vật liệu thử giống hệt nhau, do cùng một người thực hiện, sử dụng cùng thiết bị, trong một khoảng thời gian ngắn nhất có thể, không quá 5 % các trường hợp vượt quá giới hạn lặp lại r.

Các giá trị này là:

Lúa mạch:

= 7,4 mg/kg

...

...

...

Lúa mạch:

=14,4 mg/kg

r = 3,1 mg/kg

Ngô:

= 8,2 mg/kg

r = - mg/kg

Ngô:

= 16,3 mg/kg

r = 9,2 mg/kg

...

...

...

= 3,0 mg/kg

r = 1,28 mg/kg

Lúa mạch:

= 2,9 mg/kg

r = 1,37 mg/kg

Cám lúa mì:

= 4,5 mg/kg

r = 2,16 mg/kg

Cám lúa mì:

...

...

...

r = 2,23 mg/kg

8.3. Độ tái lập

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm đơn lẻ thực hiện trên vật liệu thử giống hệt nhau, do hai phòng thử nghiệm thực hiện không quá 5 % các trường hợp vượt quá giới hạn tái lập R.

Các giá trị đó là:

Lúa mạch:

=7,4 mg/kg

R = 5,6 mg/kg

Lúa mạch:

=14,4 mg/kg

...

...

...

Ngô:

= 8,2 mg/kg

R = 4,8 mg/kg

Ngô:

= 16,3 mg/kg

R = 12,9 mg/kg

Lúa mạch:

= 3,0 mg/kg

R = 1,9 mg/kg

...

...

...

= 2,9 mg/kg

R = 1,74 mg/kg

Cám lúa mì:

= 4,5 mg/kg

R = 3,35 mg/kg

Cám lúa mì:

= 3,8 mg/kg

R = 2,58 mg/kg

9. Báo cáo thử nghiệm

...

...

...

- Mọi thông tin cần thiết để nhận biết mẫu thử;

- Viện dẫn tiêu chuẩn này hoặc phương pháp đã sử dụng;

- Kết quả và đơn vị biểu thị kết quả;

- Ngày tháng lấy mẫu và kiểu loại lấy mẫu (nếu có);

- Ngày tháng nhận mẫu thử nghiệm;

- Ngày tháng thử nghiệm;

- Các điểm quan sát được trong quá trình thử nghiệm;

- Mọi thao tác không qui định trong tiêu chuẩn này, hoặc các phương án lựa chọn mà có thể ảnh hưởng đến kết quả.

...

...

...

(tham khảo)

CÁC DỮ LIỆU VỀ ĐỘ CHỤM

Theo ISO 5725:1986 [1], các thông số sau đây thu được trong một phép thử liên phòng thí nghiệm. Phép thử này được AOAC quốc tế thực hiện trong Cupertino cùng với IUPAC và Ủy ban Nordic về phân tích thực phẩm (NMKL). Tổng số có 16 phòng thử nghiệm của Châu Âu, Canada và United State tham gia thử nghiệm trên lúa mạch và ngô đã bổ sung tương ứng 10 mg/kg và 20mg/kg ocratoxin A [4], [5]. Các kết quả của nghiên cứu này được đưa ra trong Bảng A.1.

Bảng A.1

Mẫu

Lúa mạch

Lúa mạch

Ngô

Ngô

...

...

...

1990

1990

1990

1990

Số lượng phòng thử nghiệm

16

16

16

16

...

...

...

1

2

1

2

Số lượng phòng thử nghiệm còn lại sau khi trừ ngoại lệ

15

14

15

15

...

...

...

1

2

1

1

Số lượng kết quả được chấp nhận

15

28

15

30

...

...

...

7,4

14,4

8,2

16,3

Độ lệch chuẩn lặp lại s_r (mg/kg)

-

1,1

-

3,3

...

...

...

-

7,9

-

20,1

Giới hạn lặp lại r (mg/kg)

-

3,1

-

9,2

...

...

...

2,0

3,8

1,7

4,6

Độ lệch chuẩn tương đối tái lập RSD_R, %

27,2

26,5

20,7

28,4

...

...

...

5,6

10,6

4,8

12,9

Độ thu hồi, %

74

72

82

82

...

...

...

Bảng A.2

Mẫu

Lúa mạch

Lúa mạch

Lúa mạch đen

Lúa mạch đen

Cám lúa mì

Cám lúa mì

Năm tiến hành thử liên phòng thí nghiệm

...

...

...

1993

1993

1993

1993

1993

Số lượng phòng thử nghiệm

16

16

16

...

...

...

16

16

Số lượng mẫu

2

2

2

2

2

2

...

...

...

12

12

12

12

12

12

Số lượng ngoại lệ

4

4

...

...

...

4

4

4

Số lượng kết quả được chấp nhận

24

24

24

24

24

...

...

...

Giá trị trung bình (mg/kg)

3,0

2,9

4,8

2,9

4,5

3,8

Độ lệch chuẩn lặp lại s_r (mg/kg)

0,46

...

...

...

0,78

0,64

0,77

0,80

Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại RSD_r, %

15,2

17,1

16,2

22,5

...

...

...

20,8

Giới hạn lặp lại r (mg/kg)

1,28

1,37

2,18

1,80

2,16

2,23

Độ lệch chuẩn tái lập S_R (mg/kg)

...

...

...

0,62

1,11

0,84

1,20

0,92

Độ lệch chuẩn tương đối tái lập RSD_R, %

22,6

21,7

23,0

...

...

...

26,5

24,2

Giới hạn tái lập R (mg/kg)

1,90

1,74

3,10

2,34

3,35

2,58

...

...

...

-

-

65

64

68

70

CHÚ THÍCH Độ thu hồi của ocratoxin A được thêm vào mẫu lúa mạch đen không thỏa mãn các tiêu chuẩn của CEN/TC 275/WG 5. Do đó, tiêu chuẩn này không thể áp dụng cho acratoxin A trong hạt lúa mạch đen.

PHỤ LỤC B

...

...

...

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] ISO 5725:1986 Precision of test methods – Determination of repeatability and reproducibility for a standard test method by inter-laboratory tests.

[2] AOAC INTERNATIONAL Official Methods of Analysis 16^th Ed 1995, AOAC INTERNATIONAL, Gaithersburg, MD, USA, Method 991.44.

[3] Nordic Committee on Food Analysis (1992) No 143. Ochratoxin A. Liquid chromatographic determination in barley and maize.

[4] Nesheim, S., Stack, M.E., Trucksess, M.W., Eppley, R.M. and Krogh, P.: Rapid solvent-efficient method for liquid chromatographic determination of ochratoxin A in corn, barley and kidnay: Collaborative study, J. Assoc. Off. Anal. Chem. 1992, 75, 481-487.

[5] Larsson, K and Mōller, T. (1996) LC-determination of ochratoxin A in barley, wheat-bran and rye with the AOAC/IUPAC/NMKL method: A NMKL collaborative study. J. Assoc. Off. Anal. Chem. Int., 79, 1996, 1102-1106.

[6] Tauchmann, F.; Mintzlaff, H.-J.; Leistner, L.: Schutzmabnahmen beim Arbeiten mit Mykotoxinen (Protective measures for working with mycotoxins) Alimenta 1972, 11, 85.

[7] Castegnaro, M., Hunt, D.C., Sansone, E.B., Schuller, P.L., Siriwardana, M.G., Telling, G.M., van Egmond, H.P., and Walker, E.A.: Laboratory decontamination and destruction of aflatoxins B₁, B₂, G₁ and G₂ in laboratory wastes. In: IARC Scientific publication no 37, international Agency for Research on Cancer (WHO), Lyon, France; 1980, 59p.

[8] Castegnaro, M., Barek, J., Fremy, J.M., Lafontaine, M., Miraglia, M., Sansone, E.B., and Telling, G.M.: Laboratory decontamination and destruction of carcinogens in laboratory wastes. In: IARC Scientific publication no 113, International Agency for Research on Cancer (WHO), Lyon, France; 1991, 63p.

...

...

...