5.2.1.2 Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước bằng cách đun sôi. Không đun nóng môi trường quá 30 phút. Làm nguội nhanh môi trường.

Chỉnh pH sao cho sau khi đun sôi là 7,2 ± 0,2 ở 25 ^oC, nếu cần.

Phân phối môi trường theo các lượng 10 ml vào các ống nghiệm vô trùng có dung tích thích hợp (6.5).

Không khử trùng môi trường.

Môi trường có thể bảo quản đến một tháng ở 5 ^oC ± 3 ^oC .

5.2.1.3 Kiểm tra chất lượng môi trường nuôi cấy

Đối với việc xác định tính chọn lọc và hiệu quả, xem ISO/TS 11133-1. Đối với các tiêu chí thực hiện, xem ISO/TS 11133-2:2003, Bảng B.3.

5.2.2 Thạch glucozo mật đỏ tím (VRBG)

...

...

...

Dịch thủy phân mô động vật bằng enzym

Cao men

Muối mật No.3

Glucoza

Natri clorua

Đỏ trung tính

Tím tinh thể (crystal violet)

Thạch

Nước

...

...

...

3,0 g

1,5 g

10,0 g

5,0 g

0,03 g

0,002 g

9 g đến 18 g ^a)

1 000 ml

a) Phụ thuộc sức đông của thạch

...

...

...

Hòa tan các thành phần hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước bằng cách đun sôi.

Chỉnh pH sao cho sau khi đun sôi là 7,4 ± 0,2 ở 25 ^oC, nếu cần.

Phân phối môi trường nuôi cấy này vào các ống nghiệm hoặc bình vô trùng (6.5) có dung tích thích hợp.

Không khử trùng môi trường.

Sử dụng môi trường nấu chảy trong vòng 4 giờ chuẩn bị.

5.2.2.3 Chuẩn bị các đĩa thạch

Chuyển ngay vào mỗi đĩa Petri (6.7) khoảng 15 ml môi trường nuôi cấy đã được làm nguội đến khoảng từ 44 ^oC đến 47 ^oC (6.4) và để cho đông lại.

Ngay trước khi sử dụng, làm khô mặt thạch, và tốt nhất là mở nắp và để bề mặt thạch úp xuống trong tủ sấy ấm (6.3) cho đến khi bề mặt thạch được khô.

Nếu chuẩn bị trước, có thể bảo quản các đĩa thạch chưa làm khô này đến 2 tuần ở 5 ^oC ± 3 ^oC mà không làm thay đổi các thành phần của chúng.

...

...

...

Đối với việc xác định tính chọn lọc và hiệu quả, xem ISO/TS 11133-1. Đối với các tiêu chí thực hiện, xem ISO/TS 11133-2:2003, Bảng B.1.

5.2.3 Thạch dinh dưỡng

5.2.3.1 Thành phần

Cao thịt

Dịch thủy phân mô động vật bằng enzym

Natri clorua

Thạch

Nước

3,0 g

...

...

...

5,0 g

9 g đến 18 g ^a)

1 000 ml

a) Phụ thuộc sức đông của thạch

5.2.3.2 Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước bằng cách đun nóng, nếu cần.

Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng là 7,3 ± 0,2 ở 25 ^oC, nếu cần.

Phân phối môi trường nuôi cấy vào các ống nghiệm hoặc bình vô trùng (6.5) có dung tích thích hợp.

Khử trùng 15 phút trong nồi hấp áp lực (6.1) ở 121 ^oC.

...

...

...

Chuyển vào mỗi đĩa Petri (6.7) khoảng 15 ml môi trường nuôi cấy đã được làm tan chảy và nguội đến khoảng 47 ^oC và để cho đông đặc.

Ngay trước khi sử dụng, làm khô mặt thạch, và tốt nhất là mở nắp và để bề mặt thạch hướng xuống dưới ở trong tủ ấm (6.3) cho đến khi bề mặt thạch khô.

Nếu chuẩn bị trước, có thể bảo quản các đĩa thạch chưa làm khô này đến 2 tuần ở 5 ^oC ± 3 ^oC mà không làm thay đổi các thành phần của chúng.

5.2.3.4 Kiểm tra chất lượng môi trường nuôi cấy

Đối với việc xác định tính chọn lọc và hiệu quả, xem ISO/TS 11133-1. Đối với các tiêu chí thực hiện, xem ISO/TS 11133-2:2003, Bảng B.6.

5.2.4 Thạch glucoza

5.2.4.1 Thành phần

Dịch thủy phân casein bằng enzym

Cao men

...

...

...

Natri clorua

Bromcrezol tía

Thạch

Nước

10,0 g

1,5 g

10,0 g

5,0 g

0,015 g

...

...

...

1 000 ml

a) Phụ thuộc sức đông của thạch

5.2.4.2 Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước bằng cách đun nóng, nếu cần.

Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng là 7,0 ± 0,2 ở 25 ^oC, nếu cần.

Phân phối môi trường nuôi cấy vào các ống nghiệm (6.6) có dung tích thích hợp (ví dụ: 10ml môi trường cấy cho các ống nghiệm 16 mm x 160 mm).

Khử trùng 15 phút trong nồi hấp áp lực (6.1) ở 121 ^oC. Để các ống theo phương thẳng đứng.

Môi trường này có thể bảo quản đến một tuần ở 5 ^oC ± 3 ^oC.

Để loại bỏ oxy, ngay trước khi sử dụng, làm nóng môi trường trong nước sôi hoặc ở trong nồi hơi nước nóng trong 15 phút, sau đó nhanh chóng làm nguội đến nhiệt độ ủ ấm.

...

...

...

5.3.1 Thành phần

N₁N₁N¹N¹ - Tetrametyl-r-phenylen diamin dihydro clorua

Nước

1,0 g

100 ml

5.3.2 Chuẩn bị

Hòa tan thành phần trên trong nước lạnh.

Chuẩn bị thuốc thử ngay trước khi sử dụng.

Có thể sử dụng các đĩa hoặc que thử có bán sẵn. Trong trường hợp này, cần theo chỉ dẫn của nhà sản xuất

...

...

...

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm vi sinh thông thường và cụ thể như sau [xem TCVN 6404 (ISO 7218)].

6.1 Thiết bị để khử trùng khô (tủ sấy) hoặc để khử trùng ướt (nồi hấp áp lực).

Xem TCVN 6404 (ISO 7218).

6.2 Tủ ấm, có khả năng hoạt động ở 37 ^oC ± 1 ^oC.

6.3 Tủ sấy (được đối lưu không khí) hoặc tủ ấm, có khả năng hoạt động ở nhiệt độ từ 37 ^oC đến 55 ^oC.

6.4 Nồi cách thủy, hoặc thiết bị tương tự, có khả năng duy trì nhiệt độ từ 44 ^oC đến 47 ^oC.

6.5 Dụng cụ chứa, (ví dụ: chai, ống, bình), thích hợp cho việc khử trùng và bảo quản môi trường cấy.

6.6 Ống nghiệm, có kích thước khoảng 16 mm  đến 160 mm và 20 mm đến 200 mm, và các bình hoặc chai có dung tích từ 150 ml đến 500 ml.

6.7 Đĩa petri, bằng thủy tinh hoặc chất dẻo có đường kính từ 90 mm đến 100 mm.

...

...

...

6.9 Pipet chia độ, dung tích danh định 1 ml được chia độ đến 0,1 ml, có lỗ xả với đường kính thích hợp.

6.10 pH met, có độ chính xác đến ± 0,1 đơn vị pH ở 25 ^oC.

6.11 Bộ đồng hóa

Xem TCVN 6404 (ISO 7218).

7 Lấy mẫu

Điều quan trọng là phòng thử nghiệm nhận được mẫu đại điện trung thực và không bị hư hỏng hay biến đổi trong quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.

Phương pháp lấy mẫu phải tiến hành theo tiêu chuẩn riêng thích hợp với sản phẩm liên quan. Nếu không có tiêu chuẩn riêng thì các bên liên quan nên thỏa thuận với nhau về vấn đề này.

8 Chuẩn bị mẫu thử

Chuẩn bị mẫu thử theo TCVN 6507-1 (ISO 6887-1), TCVN 6507-2 (ISO 6887-2), TCVN 6507-3 (ISO 6887-3), TVCN 6507-4 (ISO 6887-4) hoặc TVCN 6263 (ISO 8261) và/hoặc các tiêu chuẩn cụ thể thích hợp với sản phẩm có liên quan. Nếu không có các tiêu chuẩn cụ thể thì các bên liên quan nên thỏa thuận với nhau về vấn đề này.

...

...

...

9.1 Khái quát

Xem TCVN 6404 (ISO 7218).

Môi trường nuôi cấy thường được ủ ở 37 ^oC. Cách khác, có thể sử dụng 2) nhiệt độ ủ là 30 ^oC.

9.2 Phương pháp phát hiện

9.2.1 Phần mẫu thử và huyền phù ban đầu

Cho phần mẫu thử (x g hoặc x ml) tùy thuộc vào độ nhạy yêu cầu và đồng hóa trong 9x ml nước đệm pepton (5.1). Chuyển một thể tích thích hợp sang ống hoặc dụng cụ chứa vô trùng (6.5) tùy theo giới hạn phát hiện yêu cầu.

9.2.2 Tiền tăng sinh không chọn lọc

Ủ huyền phù ban đầu (9.2.1) ở 37 ^oC trong 18 giờ ± 2 giờ.

9.2.3 Tăng sinh chọn lọc

...

...

...

Ủ môi trường đã cấy ở 37 ^oC trong 24 giờ ± 2 giờ.

Tiếp tục quy trình phân lập và chọn lọc để khẳng định (9.4).

9.3 Phương pháp định lượng (phương pháp MPN)

9.3.1 Phần mẫu thử, huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng tiếp theo

Tùy thuộc vào độ chính xác của các kết quả mà cấy cùng một dung dịch pha loãng vào một lượng thích hợp các bình tam giác hoặc ống (ví dụ: ba, năm hoặc mười ống hoặc bình tam giác). Về nguyên tắc, thì các kỹ thuật yêu cầu ba bình hoặc ba ống cho mỗi độ pha loãng.

Về việc chuẩn bị các huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng tiếp theo, sử dụng dịch pha loãng (5.1).

Để chuẩn bị huyền phù ban đầu, lấy phần mẫu x g hoặc x ml và đồng hóa trong 9 x ml nước đệm pepton (BPW) (5.1). Như vậy sẽ thu được dung dịch pha loãng 1/10.

CHÚ THÍCH 10 ml dung dịch pha loãng 1/10 chứa tương đương 1 g hoặc 1 ml mẫu.

Chuẩn bị các dung dịch pha loãng tiếp theo bằng cách lấy 1 ml của dung dịch pha loãng 1/10 cho vào 9 ml BPW. Lặp lại để tạo ra các dung dịch pha loãng thập phân cần thiết tiếp theo.

...

...

...

9.3.2 Tiền tăng sinh không chọn lọc

Ủ các huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng (tất cả 9 ống) (xem 9.3.1) ở 37 ^oC trong 18 giờ ± 2 giờ.

9.3.3 Tăng sinh chọn lọc

Chuyển 1 ml dịch cấy thu được trong 9.3.2 vào ống nghiệm chứa 10 ml môi trường tăng sinh (5.2.1).

Ủ môi trường đã cấy ở 37 ^oC trong 24 giờ ± 2 giờ.

9.4 Phân lập và chọn lọc để khẳng định

9.4.1 Phân lập

Lấy một vòng que cấy (6.8) từ các ống môi trường tăng sinh đã ủ ấm (xem 9.2.3) hoặc từ mỗi ống đã ủ (xem 9.3.3) cấy ria lên bề mặt đĩa chứa môi trường chọn lọc (5.2.2) và ủ các đĩa này ở 37 ^oC trong 24 giờ ± 2 giờ.

9.4.2 Chọn các khuẩn lạc để khẳng định

...

...

...

Từ mỗi đĩa đã được ủ ẩm (9.4.1) trên đó có các khuẩn lạc đặc trưng đã phát triển, chọn một khuẩn lạc đặc trưng tách biệt rõ để thử khẳng định sinh hóa (xem 9.6) sau khi được cấy truyền (xem 9.5).

Nếu có nhiều hơn một hình thái có mặt trong các khuẩn lạc, thì mỗi hình thái chọn một khuẩn lạc để cấy truyền.

Enterobacteriaceae đích thực có thể làm phai màu các khuẩn lạc của chúng hoặc của môi trường. Do đó, khi không có mặt các khuẩn lạc đặc trưng, thì chọn các khuẩn lạc hơi trắng để khẳng định.

9.5 Cấy truyền

Ria lên các đĩa thạch dinh dưỡng (5.2.3) từng khuẩn lạc đã được chọn để thử khẳng định (xem 9.4.2).

Ủ các đĩa này ở 37 ^oC trong 24 giờ ± 2 giờ.

Chọn khuẩn lạc được tách biệt rõ từ các đĩa đã ủ ấm để thử khẳng định sinh hóa (xem 9.6).

9.6 Thử khẳng định sinh hóa

9.6.1 Phản ứng oxidaza

...

...

...

Phép thử được coi là âm tính khi màu của giấy lọc đó không chuyển sang màu sẵm trong vòng 10 giây.

Cần theo hướng dẫn của nhà sản xuất đối với các đĩa chế tạo sẵn.

9.6.2 Thử lên men

Dùng que cấy (6.8) lấy cùng một loại khuẩn lạc đã được chọn trong 9.5 mà cho phép thử oxidaza âm tính cấy đâm sâu vào các ống chứa thạch glucoza (5.2.4).

Ủ các ống này ở 37 ^oC trong 24 giờ ± 2 giờ.

Nếu màu vàng lan khắp ống thạch, thì phản ứng được coi là dương tính.

10 Biểu thị kết quả

10.1 Các ống khẳng định dương tính

Nếu có bất kỳ khuẩn lạc điển hình được chọn (9.4.2) từ đĩa cấy truyền (xem 9.4.1) có phản ứng oxidaza âm tính và glucoza dương tính, thì ống nghiệm chứa mẫu cấy truyền đó được coi là dương tính với Enterobacteriaceae.

...

...

...

Theo các kết quả giải thích (xem 10.1), chỉ rõ sự có mặt hay không có mặt Enterobacteriaceae trong phần mẫu thử của x g hoặc x ml sản phẩm [xem TCVN 6404 (ISO 7218)].

10.3 Phương pháp định lượng: Tính số có xác suất lớn nhất (MPN)

Tính số có xác suất lớn nhất từ số ống dương tính tại mỗi độ pha loãng. Xem TCVN 6404 (ISO 7218), 9.4.

11 Độ chụm

Thực tế cho thấy, kỹ thuật MPN có kết quả dao động rất lớn. Vì vậy các kết quả thu được theo phương pháp này phải hết sức cẩn thận. Giới hạn tin cậy xem TCVN 6404 (ISO 7218), Phụ lục A.

12 Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm chỉ ra:

- mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử.

- phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

...

...

...

- nhiệt độ ủ ấm đã sử dụng;

- tất cả các chi tiết thao tác không qui định trong tiêu chuẩn này, cùng với các chi tiết bất thường nào khác có thể ảnh hưởng tới kết quả;

- các kết quả thử nghiệm thu được.

Phụ lục A

(Qui định)

Sơ đồ qui trình của phương pháp phát hiện

...

...

...

(Qui định)

Sơ đồ qui trình đối với kỹ thuật MPN