Một nghiên cứu cộng tác khác gồm 13 phòng thử nghiệm tham gia phân tích trên hai mẫu để kiểm tra xác nhận phương pháp chiết tryptophan. Trên mỗi mẫu thực hiện năm phép phân tích kép. Các kết quả được nêu trong Bảng A.2.

Bảng A.2

Mẫu 4
Hỗn hợp lúa mì và đậu tương

Mẫu 5
Hỗn hợp lúa mì và đậu tương (= 4 mẫu) có bổ sung tryptophan (0,457 g/kg)

Số lượng phòng thử nghiệm gửi kết quả

12

12

Số lượng kết quả thử nghiệm từ các phòng thử nghiệm còn lại

...

...

...

60

Giá trị trung bình , g/kg

0,391

0,931

Độ lệch chuẩn lặp lại, s_r, g/kg

0,005

0,012

Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, %

1,34

...

...

...

Giới hạn lặp lại, r (= 2,8 s_r), g/kg

0,014

0,034

Độ lệch chuẩn tái lập, s_R, g/kg

0,018

0,048

Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, %

4,71

5,11

...

...

...

0,05

0,134

Một phép thử liên phòng thử nghiệm khác gồm bảy phòng thử nghiệm tiến hành phân tích trên bốn mẫu để kiểm tra xác nhận phương pháp tryptophan đối với việc thủy phân. Các kết quả được nêu trong Bảng A.3.Trên mỗi mẫu thực hiện năm phép phân tích kép.

Bảng A.3

Mẫu 1
Thức ăn cho lợn đã được trộn trước (CMR 117)

Mẫu 2
Bột cá có hàm lượng chất béo thấp (CRM 118)

Mẫu 3
 Bột đậu tương (CRM 119)

Mẫu 4
Sữa bột gầy (CRM 120)

...

...

...

7

7

7

7

Số lượng kết quả thử nghiệm từ các phòng thử nghiệm còn lại

25

30

30

30

...

...

...

2,064

8,801

6,882

5,236

Độ lệch chuẩn lặp lại, s_r, g/kg

0,021

0,101

0,089

0,040

...

...

...

1,04

1,15

1,30

0,76

Giới hạn lặp lại, r (= 2,8 s_r), g/kg

0,059

0,283

0,249

0,112

...

...

...

0,031

0,413

0,283

0,221

Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, %

1,48

4,69

4,11

4,22

...

...

...

0,087

1,156

0,792

0,619

Phụ lục B

(tham khảo)

Các lưu ý về phương pháp

B.1 Các điều kiện sắc ký đặc biệt sau đây có thể giúp cho cho việc tách tryptophan và tốt hơn.

...

...

...

Cột sắc ký lỏng

125 x 4 mm, được nhồi bằng C₁₈, 5  hoặc loại tương đương

Nhiệt độ cột:

32 ^oC

Pha động:

A: 0,01 mol/l KH₂PO₄/metanol, 95 + 5 (phần thể tích)

B: Metanol

Chương trình gradient

...

...

...

100 % A

0 % B

15 phút

100 % A

0 % B

17 phút

60 % A

...

...

...

19 phút

60 % A

40 % B

21 phút

100 % A

0 % B

...

...

...

100 % A

0 % B

Tốc độ dòng:

1,2 ml/phút

Tổng số thời gian vận hành:

khoảng 33 phút

...

...

...

B.2 Việc chạy sắc ký sẽ thay đổi tùy theo loại HPLC và vật liệu nhồi cột được sử dụng. Hệ thống được lựa chọn phải có khả năng tách đường nền của tryptophan và chất nội chuẩn. Tuy nhiên, quan trọng nhất là các sản phẩm phân hủy được tách ra khỏi tryptophan và chất nội chuẩn. Dịch thủy phân không chứa chất nội chuẩn phải được chạy sắc ký để kiểm tra đường nền về tạp chất của chất nội chuẩn. Điều quan trọng là thời gian chảy đủ lâu để rửa giải hết các sản phẩm phân hủy, trái lại các pic rửa giải chậm có thể cản trở cho việc chạy sắc ký sau đó.

Hệ thống sắc ký cần cho độ nhạy tuyến tính trên khắp dải vận hành. Độ nhạy tuyến tính phải được đo với nồng độ không đổi (chuẩn) của chất nội chuẩn và các nồng độ khác nhau của tryptophan. Điều quan trọng là cỡ pic của cả tryptophan và chất nội chuẩn đều nằm trong dải tuyến tính của hệ thống HPLC/ huỳnh quang. Nếu các pic của tryptophan và/hoặc chất nội chuẩn là quá thấp hoặc quá cao, thì phải lặp lại phép phân tích với cỡ mẫu khác và/hoặc thay đổi thể tích cuối cùng.

B.3 Nếu để quá lâu, thì bari hydroxit trở nên khó hòa tan. Điều này dẫn đến dung dịch không trong đối với phép xác định HPLC và cho kết quả thấp đối với tryptophan.

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Commission directive 2000/45/EC of July 2000, establishing Community methods of analysis for the determination of vitamin A, vitamin E and tryptophan in feedingstuffs.