D.3.2.1.2. Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trên trong nước.

Đun đến sôi, có khuấy trộn. Không hấp áp lực.

Không để môi trường ở nhiệt độ cao dài hơn thời gian cần thiết.

Làm nguội môi trường đến khoảng từ 47 °C đến 50 °C.

D.3.2.2. Dung dịch Novobioxin

D.3.2.2.1. Thành phần

Muối natri novobioxin

0,05 g

...

...

...

10 ml

D.3.2.2.2 Chuẩn bị

Hòa tan muối natri novobioxin trong nước.

Lọc qua màng lọc cỡ lỗ 0,22 mm để khử trùng.

Dung dịch này có thể bảo quản được đến bốn tuần ở 5 °C ± 3 °C hoặc bảo quản với các lượng nhỏ (ví dụ: 2 ml) đến một năm ở - 20 °C.

D.3.2.3. Môi trường hoàn chỉnh

D.3.2.3.1. Thành phần

Môi trường cơ bản (D.3.2.1)

1 000 ml

...

...

...

2 ml

D.3.2.3.2. Chuẩn bị

Bằng kỹ thuật vô trùng, cho 2 ml dung dịch novobioxin (D.3.2.2) vào 1 000 ml môi trường cơ bản (D.3.2.1) ở 47 °C đến 50 °C. Trộn kỹ.

pH cuối cùng phải là 5,2 (từ 5,1 đến 5,4) ở 20 °C đến 25 °C.

Rót môi trường vào các đĩa Petri đuờng kính 90 mm, đến thể tích khoảng từ 15 ml đến 20 ml.

Để cho môi trường đông đặc lại trước khi di chuyển và cẩn thận khi xử lý.

Bảo quản các đĩa này với mặt đĩa hướng lên trên đến hai tuần ở nơi tối và ở nhiệt độ 5 °C ± 3 °C.

Không lật úp đĩa, vì thạch nửa đặc rất loãng.

Không sử dụng bất kỳ đĩa đựng môi trường nửa đặc chọn lọc nào đã bị hóa lỏng hoặc phân mảnh.

...

...

...

D.4. Thiết bị, dụng cụ thủy tinh

Sử dụng các dụng cụ được liệt kê trong điều 6, và cụ thể như sau:

D.4.1. Que cấy vòng vô trùng, 1 ml.

D.5. Lấy mẫu

Xem điều 7.

D.6. Chuẩn bị mẫu thử

Xem điều 8.

Nhìn chung, cần cho một lượng mẫu thử vào BPW để có được độ pha loãng 1/10 (ví dụ: 25 g mẫu được cho vào 225 ml BPW). Tuy nhiên, đối với một vài loại mẫu có thể cần thiết phải dùng tỷ lệ khác

D.7. Cách tiến hành

...

...

...

Làm ấm sơ bộ BPW đến nhiệt độ phòng trước khi sử dụng.

Trộn kỹ các mẫu bằng cách thích hợp nhất đối với từng loại mẫu.

Cân mẫu và bổ sung một lượng thích hợp BPW (xem D.6). Ủ các binh ở 37 °C ± 1 °C trong 18 h ± 2 h.

D.7.2. Tăng sinh chọn lọc

Để các đĩa MSRV cân bằng đến nhiệt độ phòng nếu chúng được bảo quản ở nhiệt độ thấp hơn.

Cấy vào các đĩa MSRW 3 giọt dịch cấy trong môi trường BPW. Tổng thể tích 3 giọt này phải là 0,1 ml và phải được cho vào một cách riêng rẽ và cách đều nhau trên bề mặt môi trường.

Khi lấy mẫu từ BPW để cấy truyền, thì điều cơ bản là không làm xáo trộn các mẫu dạng hạt. Do đó, các hộp đựng cần được di chuyển cẩn thận, không xáo trộn, lắc hoặc xoay. Chiết một chủng cấy từ thể tích lớn nhất của phần dịch lỏng tự do gần nhất với mặt tiếp giáp giữa hộp đựng và bề mặt dịch cấy, nhưng nên lấy sâu hơn nếu có các hạt nổi phía trên bề mặt.

Ủ các đĩa MSRV đã cấy ở 41,5 °C ± 1 °C trong 24 h ± 3 h.

Không lật úp các đĩa.

...

...

...

Nếu các đĩa âm tính sau 24 h, thì ủ tiếp 24 h ± 3 h.

D.7.3. Cấy lên đĩa chọn lọc

Để cho các đĩa thạch xyloza lysin deoxycholat (XLD) và môi trường đổ đĩa chọn lọc thứ hai (xem 5.2.4.2) cân bằng đến nhiệt độ phòng nếu chúng được bảo quản ở nhiệt độ thấp hơn. Làm khô bề mặt đĩa trước khi sử dụng, nếu cần.

Cấy truyền các đĩa MSRV dương tính:

Quan sát đĩa MSRV (trên bề mặt trắng sáng hoặc hộp sáng). Xác định các điểm lan tỏa phát triển mờ đục xa nhất tính từ điểm cấy và nhúng que cấy vòng 1 ml vào ngay phía trong vùng tiếp giáp vùng mờ đục. Lấy que cấy vòng ra sao cho không lấy phải các mảng lớn của MSRV. Cấy lên bề mặt đĩa XLD sao để thu được các khuẩn lạc tách biệt rõ. Thực hiện tương tự với môi trường đổ đĩa chọn lọc thứ hai, sử dụng que cấy vòng vô trùng mới.

CHÚ THÍCH Có thể thu được các khuẩn lạc tách biệt rõ khi sử dụng một lượng nhỏ môi trường MSRV đổ đĩa (dùng que cấy vòng 1 ml), sử dụng một đĩa Petri cỡ chuẩn (90 mm đến 100 mm) với thạch đổ đĩa chọn lọc. Do đó không cần thiết sử dụng đĩa Petri cỡ lớn.

Ủ các đĩa XLD lật úp ở 37 °C ± 1 °C trong 24 h ± 3 h.

Ủ các đĩa đựng môi trường đổ đĩa chọn lọc thứ hai theo chỉ dẫn của nhà xản xuất.

Đặt lại các đĩa MSRV âm tính vào tủ ấm ở 41,5 °C và ủ tiếp trong 24 h ± 3 h. Nếu sau khi ủ 48 h các đĩa MSRV trở thành dương tính thì tiến hành quy trình đổ đĩa chọn lọc.

...

...

...

Salmonella thay đổi âm tính H₂S (ví dụ: Salmonella Paratyphi) mọc trên thạch XLD có màu hồng với tâm màu hồng đậm. Salmonella dương tính lactoza mọc trên thạch XLD là màu vàng có hoặc không có màu đen (xem thêm 9.4.4).

Kiểm tra môi trường đổ đĩa chọn lọc thứ hai sau thời gian ủ thích hợp về sự có mặt các khuẩn lạc có các đặc trưng được coi là Salmonella giả định.

D.7.4. Khẳng định

Để khẳng định các khuẩn tạc điển hình được phân lập trên môi trường đổ đĩa chọn lọc, tiến hành theo các chỉ dẫn nêu trong 9.5. Trong 9.5.2 buộc phải cấy vạch các khuẩn lạc phân lập từ môi trường đổ đĩa chọn lọc lên thạch dinh dưỡng trước khi tiến hành khẳng định bằng sinh hóa. Tuy nhiên, bước cấy thêm này là không cần thiết nếu các khuẩn lạc tách biệt rõ (dịch cấy thuần chủng) sẵn có trên môi trường đổ đĩa chọn lọc. Trong trường hợp này tiến hành khẳng định sinh hóa trực tiếp trên một khuẩn lạc tách biệt rõ, điển hình (nghi ngờ) của từng môi trường đổ đĩa chon lọc.

D.8. Biểu thị kết quả

Xem điều 10.

D.9. Báo cáo thử nghiệm

Xem điều 11.

D.10. Đảm bảo chất lượng

...

...

...

Để kiểm tra hiệu quả của môi trường, tiến hành theo ISO/TS 11133-1 và ISO/TS 11133-2. Tuy nhiên, trong các tài liệu này, các quy trình đưa ra đối với canh thang chọn lọc cũng như môi trường thạch chọn lọc để phát hiện Salmonella, nhưng không dùng cho môi trường nửa đặc như MSRV. Quy trình nêu dưới đây có thể sử dụng để kiểm tra hiệu quả của MSRV và được dựa trên quy trình và các chủng thử nghiệm đã mô tả cho môi trường chọn lọc (tăng sinh) để phát hiện Salmonella (ví dụ như RVS và MKTTn, xem bảng B.2 và B.3) trong ISO/TS 11133-2.

Quy trình mô tả dưới đây được trích từ 5.4.2.1 của ISO/TS 11133-2:2003 nhưng đã điều chỉnh nồng độ chủng thử nghiệm cho thích hợp. Quy trình, các chủng thử nghiệm và các chuẩn cứ được nêu trong bảng D.1.

- Cấy vi sinh vât mục tiêu: Cấy vào môi trường MSRV đối với từng vi sinh vật thử nghiệm với khoảng 10⁴ cfu/0,1 ml (để chuẩn bị chủng cấy, xem 5.2.1 của ISO/TS 11133-2:2003).

- Cấy vi sinh vật không mục tiêu: Cấy vào môi trường MSRV đối với từng vi sinh vật thử nghiệm với khoảng từ 10⁵ cfu đến 10⁶ cfu/0,1 ml (để chuẩn bị chủng cấy, xem 5.2.1 của ISO/TS 11133-2:2003).

- Cấy vi sinh vật mục tiêu và không mục tiêu làm dịch cấy hỗn hợp: Cấy vào môi trường MSRV đối với dịch cấy hỗn hợp chứa khoảng 10⁴ cfu/0,1 ml vi sinh vật mục tiêu và khoảng từ 10⁵ cfu đến 10⁶ cfu/0,1 ml vi sinh vật không mục tiêu (để chuẩn bị các chủng cấy, xem 5.2.1 của ISO/TS 11133-2:2003).

Ủ các đĩa MSRV ở 41,5 °C ± 1 °C và đánh giá các đĩa sau 24 h ± 3 h và sau 48 h ± 6 h.

Bảng D.1 - Kiểm tra hiệu quả của môi trường MSRV

Chức năng

Chủng kiểm chứng

...

...

...

Ủ môi trường MSRV

Chuẩn cứ

Tính đặc thù

S.Typhimurium ATCC 14028 hoặc S.Enteritidis ATCC 13076

10⁴ cfu

41,5 °C ± 1 °C, 2 x 24 h ± 3 h

Xám trắng, quầng mờ đục bao quanh giọt cấy. Sau 48 h, các quầng đục quanh 3 giọt lan tỏa (gần) khắp đĩa.

Tính chọn lọc

E.coli ATCC 25922 hoặc ATCC 8739

...

...

...

10⁵ cfu đến 10⁶ cfu

41,5 °C ± 1 °C, 2 x 24 h ± 3 h

Có thể phát triển tại giọt cấy mà không có quầng đục.

Năng suất

S.Typhimurium ATCC 14028 hoặc S.Enteritidis ATCC 13076

+

10⁴ cfu

41,5 °C ± 1 °C, 2 x 24 h ± 3 h

Xám trắng, quầng mờ đục bao quanh giọt cấy. Sau 48 h, các quầng đục quanh 3 giọt lan tỏa (gần) khắp đĩa.

...

...

...

E.coli ATCC 25922 hoặc ATCC 8739

10⁵ cfu đến 10⁶ cfu

+

P.aeruginoza ATCC 27853

10⁵ cfu đến 10⁶ cfu

...

...

...

Thư mục tài liệu tham khảo

Xóa tài liệu tham khảo [4] và đánh số lại các thứ tự khác.

Bổ sung các tài liệu tham khảo dưới đây vào Thư mục tài liệu tham khảo.

[7]  VOOGT, N., Raes, M., Wannet, W.J.B., HENKEN.A.M. and VAN DE GIESSEN, A.W. Comparison of selective enrichment media for the detection of Salmonella in poultry faeces. Letter in Applied Microbiology, 32, 2001, pp. 89-92

[8]  DE SMEDT, J.M., BOLDEROIJK, R.F., RAPPOLD, H. and LAUTENSCHLAEGER, D. Rapid Salmonella detection in foods by motility enrichment on a modified semi-solid Rappaport-Vassiliadis medium. Journal of Food Protection, 49(7), 1986, pp. 510-514

[9]  VEENMAN, C, KORVER, H. and MOOIJMAN, K.A. Improvements in the method for detection of Salmonella spp. in animal faeces. National Institute for Public Health and the Environment, Bilthoven the Netherlands. RIVM report 330300 010, 2007

[10]  SOUTOURINA, O.A., SEMENOVA, E.A., PARFENOVA, V.V., DANCHIN, A. and BERTIN, P. Control of bacterial motility by environmental factors in polarly flagellated and peritichous bacteria isolated from lake Baikal. Applied and Environmental Microbiology, 67(9), 2001, pp. 3852-3859