6.5.3  Các thuốc thử khác

6.5.3.1  Chất đồng kết tủa ADN, được sử dụng để cải thiện năng suất kết tủa trong quá trình tách chiết ADN, không được chứa hoạt tính nuclease hoặc trình tự tương đồng với trình tự đích của các thử nghiệm PCR.

6.5.3.2  Dung dịch đệm TE, pH 8,0

Tris (hydroxymethyl) aminomethane (C₄H₁₁NO₃)

Tris

10 mmol/L

Axit ethylenediaminetetraacetic (C₁₀H₁₆N₂)

EDTA

1 mmol/L

...

...

...

Hòa tan tris và EDTA trong nước không chứa ADNse và RNAse và chỉnh bằng HCl đến pH 8,0. Để pha loãng dung dịch đệm TE 10 lần, thì pha loãng dung dịch này với nước không có ADNse và RNAse.

6.6  Khử nhiễm thiết bị và cơ sở thí nghiệm

Sau khi nhiễm ngẫu nhiên hoặc không ngẫu nhiên, thì mọi thiết bị hoặc vật liệu có thể sử dụng lại đều phải được xử lý bằng cách nhúng hoặc ngâm trong, ví dụ, dung dịch thuốc tẩy chứa clo hoạt tính 1,7 % thể tích hoặc axit clohydric 1 % thể tích hoặc chất tẩy rửa.

Bức xạ cực tím cũng có thể được sử dụng để khử nhiễm vật liệu hoặc các thiết bị nhỏ, bề mặt bàn hoặc thậm chí toàn bộ phòng bổ sung cho việc khử nhiễm bằng dung dịch.

6.7  Xử lý và loại bỏ chất thải

Chất thải độc hại và lây nhiễm phải được lưu giữ, sử dụng và loại bỏ theo quy định. Khuyến cáo loại bỏ ngay các vật tư tiêu hao đã bị nhiễm các sản phẩm khuếch đại.

7  Cách tiến hành

...

...

...

Lọc một lượng mẫu càng lớn càng tốt (ít nhất 50 ml) để cô đặc vi khuẩn. Ghi lại thể tích (V) của mẫu được lọc. Điều này được yêu cầu trong phần tính toán kết quả (xem Điều 8). Giới hạn phát hiện, LD_meth (xem 9.5) và giới hạn định lượng, LQ_meth (xem 9.4.4), bị ảnh hưởng bất lợi bởi các lượng mẫu nhỏ và tăng tương ứng.

7.2  Tách chiết ADN

7.2.1  Yêu cầu chung

Quá trình tách chiết liên quan đến việc giải phóng ADN bằng cách phân giải vi sinh vật, sau đó (hoặc xảy ra đồng thời) tinh sạch ADN trong khi loại bỏ các thành phần khác càng nhiều càng tốt, đặc biệt là các chất ức chế PCR. Kiểm tra độ thu hồi ADN của dịch chiết (xem 9.6).

7.2.2  Quy trình

ADN có thể được tách chiết trực tiếp ra khỏi màng lọc. Nên xử lý toàn bộ phần cô đặc.

Để tách chiết ADN, có thể sử dụng một số phương pháp thích hợp như vật lý (ví dụ như chu trình cấp đông và rã đông, nghiền hạt), hóa học (ví dụ như đệm guanidine thiocyanat) hoặc sinh học (ví dụ: phân hủy bằng enzym).

Bước tinh sạch có thể được thực hiện sau hoặc đồng thời với bước tách chiết ADN. Bước tinh sạch này có thể được thực hiện, ví dụ, sử dụng cloroform và/hoặc bằng cách kết tủa phân đoạn, với các dung môi như etanol, isopropanol, và/hoặc hấp phụ trên nền rắn (ví dụ như nhựa resin, silica, thủy tinh, màng, hạt từ tính).

ADN đã tinh sạch phải được đưa trở lại dạng huyền phù trong dung dịch đảm bảo tính ổn định của ADN và chất lượng của PCR, ví dụ, dung dịch đệm có chứa chất tạo chelat magiê (EDTA) hoặc protein (albumin huyết thanh bò).

...

...

...

7.2.3  Tính ổn định của dịch chiết ADN

Sau khi tách chiết ADN, dịch chiết ADN có thể được sử dụng để chạy PCR. Mặc dù được khuyến nghị thực hiện PCR trực tiếp sau khi tách chiết, nhưng có thể bảo quản dịch chiết ADN trong 24 h ở (5 ± 3) °C. Khi cần bảo quản lâu hơn ở nhiệt độ này thì cần phải đánh giá xác nhận.

Trong trường hợp dịch chiết ADN được lưu trữ lâu hơn hơn 24 h, thì bảo quản dịch chiết ADN ở (-18 ± 2) °C; các điều kiện bảo quản này phải được đánh giá xác nhận.

7.3  Khuếch đại ADN bằng PCR

7.3.1  Quy định chung

Điều này liên quan đến việc khuếch đại trình tự đích giới hạn theo hướng 5'- đến -3' trên mỗi sợi ADN được bắt đầu bởi hai mồi (mồi ngược và mồi xuôi).

Trong quá trình phát triển thử nghiệm PCR, các thông số khuếch đại (số chu trình, nhiệt độ lai) và thành phần hỗn hợp phản ứng (dNTP, magie, mồi và đệm) phải được xác định và tối ưu hóa. Khi các thông số này đã được thiết lập, hiệu năng của phương pháp phải được đánh giá (xem Điều 9).

Việc khuếch đại PCR phải bao gồm các đối chứng nêu trong Điều 10 (đối chứng âm tính và đối chứng dương tính, kiểm soát ức chế PCR và mẫu chuẩn).

7.3.2  Trình tự đích, mồi và đoạn dò

...

...

...

Có thể khuếch đại một hoặc nhiều trình tự để phát hiện và phân biệt ADN với vi khuẩn thuộc Legionella spp. và L. pneumoniaophila.

Tính đặc hiệu của mồi và các đoạn dò phải được kiểm tra:

a) Về mặt lý thuyết bằng nghiên cứu tính tương đồng sử dụng phần mềm thích hợp trong cơ sở dữ liệu chính như Ngân hàng gen NCBI (xem Tài liệu tham khảo [1]) hoặc cơ sở dữ liệu trình tự Nucleotit EMBL (xem Tài liệu tham khảo [2])

b) Bằng cách thử nghiệm trên các chủng Legionella, L. pneumophila và các chủng vi sinh vật có khả năng được tìm thấy trong cùng điều kiện sinh thái như Legionella.

Liên quan đến điểm b), cần kiểm tra một danh mục với số lượng tối thiểu các chủng được đưa ra trong 9.2. Đối với các chủng không thuộc giống Legionella, không có sản phẩm khuếch đại nào được phát hiện bởi real-time PCR. Tính đặc hiệu của các đoạn dò và mồi phải được đánh giá trên mỗi chủng Legionella mới. Đối với L. pneumoniaophila, các trình tự được mô tả dưới đây tương thích với danh mục các chủng cần kiểm tra tính đặc hiệu. Có thể sử dụng các trình tự khác miễn là chúng phù hợp các yêu cầu về loại trừ và tính bao gồm (xem danh mục trong 9.2).

Dưới đây là các ví dụ về mồi (7.3.2.2 và 7.3.2.3) và đoạn dò (7.3.2.4) được thiết kế để khuếch đại và định lượng L. pneumophila mảnh đặc hiệu của mip (7.3.2.5). Các trình tự và fluorofor được đưa ra để làm ví dụ.

Các chế phẩm này được đưa ra làm ví dụ và phải được đánh giá xác nhận theo Điều 9.

7.3.2.2  Ví dụ về mồi xuôi L. pneumophila: LpneuF có thành phần như sau:

Trình tự: 5'-CCGATGCCACATCATTAGC-3’^[6];

...

...

...

Ví dụ, LpneuF được chuẩn bị như sau: Chuẩn bị dung dịch gốc của mồi trong dung dịch đệm TE pha loãng 10 lần với nồng độ cuối cùng là 100 μmol/L. Bảo quản dung dịch gốc này dưới -18 °C. Pha loãng dung dịch gốc thành dung dịch làm việc có nồng độ 10 μmol/L. Để chuẩn bị cả dung dịch gốc và dung dịch làm việc, sử dụng dung dịch đệm TE pha loãng 10 lần. Bảo quản dung dịch làm việc này trong tối đa sáu tháng dưới -18 °C.

7.3.2.3  Ví dụ về mồi ngược L. pneumophila: LpneuR có thành phần như sau:

Trình tự: 5'-CCAATTGAGCGCCACTCATAG-3’[6];

Dung dịch đệm TE (6.3.3.2) được pha loãng 10 lần.

CHÚ THÍCH: Ví dụ, LpneuR được chuẩn bị theo cách tương tự như LpneuF (7.3.2.2).

7.3.2.4  Ví dụ về đoạn dò L. pneumophila: LpneuP có thành phần như sau:

Trình tự: 5'-TGCCTTTAGCCATTGCTTCCG-3’^[6];

Label5’: Fluorophore (carboxyfluorescein, FAM):

Label 3': Quencher (black hole quencher 1, BHQ1);

...

...

...

CHÚ THÍCH: Ví dụ, LpneuP được chuẩn bị theo cách tương tự như LpneuF (7.3.2.2).

7.3.2.5  Ví dụ về mồi xuôi 16S gen rRNA gen mồi xuôi Legionella spp., có thành phần như sau:

Trình tự: 5'GGAGGGTTGATAGGTTAAGAGCT 3'[5]

Đệm TE (6.5.3.2): được pha loãng 10 lần.

Ví dụ về 16SrRNAgeneF được chuẩn bị như sau. Chuẩn bị dung dịch gốc của mồi trong dung dịch đệm TE pha loãng 10 lần với nồng độ cuối cùng là 100 μmol/l. Bảo quản dung dịch gốc này dưới -18 °C. Pha loãng dung dịch gốc thành dung dịch làm việc nồng độ 10 μmol/l. Để chuẩn bị cả dung dịch gốc và dung dịch làm việc, sử dụng dung dịch đệm TE pha loãng 10 lần. Bảo quản dung dịch làm việc này trong tối đa sáu tháng dưới -18 °C.

7.3.2.6  Ví dụ về mồi ngược gen 165 rRNA mồi ngược Legionella spp: 16SrRNAgeneR, với thành phần như sau:

Trình tự: 5'CCAACAGCTAGTTGACATCGTTT 3’[5];

Đệm TE (6.5.3.2): pha loãng 10 lần.

CHÚ THÍCH: 16SrRNAgeneR được chuẩn bị theo cách tương tự như LpneuF (7.3.2.5).

...

...

...

Trình tự: 5'-AGTGGCGAAGGCGGCTACCT- 3'[5];

Label 5': Fluorophore (carboxyfluorescein, FAM);

Label 3': Quencher (black hole quencher 1, BHQI);

Đệm TE (6.5.3.2).

CHÚ THÍCH: 16SrRNAgeneP được chuẩn bị theo cách tương tự như LpneuF (7.3.2.5).

7.3.2.8  Trình tự ADN của mảnh mip của L. pneumophila.

Trình tự của mồi và đoạn dò được xác định bằng chữ in đậm (xem [5]).

7.3.2.9  Trình tự ADN của đoạn gen 165 rRNA của các loài Legionella.

...

...

...

7.3.3  Chuẩn bị hỗn hợp khuếch đại

Tốt nhất, chuẩn bị ngay hỗn hợp phản ứng trước khi sử dụng. Nếu hỗn hợp phản ứng được bảo quản, thì độ ổn định của nó phải được xác nhận bằng cách thực hiện kiểm tra độ tuyến tính của hàm hiệu chuẩn sau khi bảo quản (xem 9.3). Việc đánh giá xác nhận này phải đáp ứng các tiêu chí xác định trong 9.3.4.

Hỗn hợp phản ứng và ADN tách chiết được phải được trộn ngay trước khi khuếch đại. Để ngăn ngừa hậu quả của việc lây nhiễm ngẫu nhiên, có thể thực hiện khuếch đại PCR từ dUTP để hoạt hoá UNG (uracil-ADN N-glycosylase) loại bỏ tất cả các dấu vết của amplicon trước khi có khuếch đại mới.

Ví dụ về thành phần của hỗn hợp phản ứng được nêu trong Bảng 2. Trộn các thành phần theo tỷ lệ được nêu trong Bảng 2.

7.4  Phát hiện định lượng

7.4.1  Yêu cầu chung

Phương pháp real-time PCR này phải có thể định lượng được các amplicon đặc hiệu đối với Legionella spp.và/hoặc L. Pneumophila. Nên thực hiện qPCR đối với Legionella spp. và L. Pneumophila trong hai giếng PCR riêng biệt. Tiêu chuẩn này không mô tả phát hiện nhiều thành phần. Việc phát hiện nhiều thành phần (Legionella spp. và L. pneumoniaophila trong cùng giếng PCR) không quy định trong tiêu chuẩn này.

Tính đặc hiệu của PCR định lượng phải được đảm bảo bằng cách sử dụng đoạn dò lai đặc hiệu

...

...

...

a) Dải chuẩn ADN bên ngoài, tức là các dung dịch ADN L. pneumophila, thu được từ chất chuẩn gốc (xem 10.2).

b) Kiểm soát ức chế PCR, như dung dịch đã hiệu chuẩn của plasmid hoặc oligonucleotide hoặc đơn vị gen L. pneumophila, được đồng khuếch đại với ADN từ mẫu. Cách tiếp cận này được sử dụng để phát hiện sự có mặt của chất ức chế trong dịch chiết ADN mẫu (xem 10.6). Sự khuếch đại của kiểm soát ức chế PCR sẽ được phát hiện bằng cách sử dụng một đoạn dò đặc hiệu được thiết kế với reporter khác với đoạn dò đích.

Liên quan đến việc phát hiện (có mặt hay không có mặt) gen đích, kết quả được coi là dương tính (sự có mặt gen đích) khi giá trị C_t thấp hơn giá trị C_t tương ứng với 1 GU. Giá trị C_t này được ước tính (b) trong quá trình xác định đặc tính và đánh giá xác nhận phương pháp (xem 9.3.2) trong phương trình tuyến tính y = ax'+ b.

Cần phải khuếch đại các chất chuẩn đã được hiệu chuẩn bên ngoài và sự kiểm soát ức chế bằng cách sử dụng cùng các đoạn mồi được sử dụng để khuếch đại các trình tự đích của mẫu.

Số lượng của kiểm soát ức chế PCR phải thấp hơn 1000 cADN trên phản ứng.

Trong các phương pháp tiếp cận a) và b) việc định lượng được thực hiện bằng phép nội suy trong dải đáp ứng tuyến tính của phương pháp định lượng ADN. Dải nồng độ này phải được xác định trước trong quá trình xác định và đánh giá xác nhận phương pháp (9.3). Nếu cần, ADN được tách chiết có thể được pha loãng để thu được nồng độ nằm trong vùng đáp ứng tuyến tính này.

Quá trình khuếch đại phải được thực hiện bằng máy chu trình nhiệt real-time PCR real-time với đủ số chu trình. Số chu trình này không được nhỏ hơn giá trị ước tính của giá trị ngưỡng tín hiệu của trục tung (xem 9.3) tăng lên 5.

QUAN TRỌNG - Khi có thể, nên thực hiện một vài lần chạy sử dụng cùng dịch tách chiết ADN. Lặp lại các thử nghiệm và thu được kết quả trung bình giúp cải thiện độ chính xác.

Bảng 2 - Ví dụ về thành phần của hỗn hợp qPCR

...

...

...

Thể tích/mẫu, ml

Nồng độ cuối cùng

BSA dùng để khuếch đại PCR

5

0,4 μg/μL

Taq polymerasea

1

0,1 U/μL

Đệm PCR (Bảng 1)

...

...

...

1x

dNTPs (Bảng 1)

1

400 nmol/L

MgCl₂^a (Bảng 1)

3

Theo các yêu cầu của Taq ADN polymerase

Mồi LpneuF (7.3.2.2)

1

...

...

...

Mồi LpneuR (7.3.2.3)

1

200 nmol/L

Đoạn dò LpneuP (7.3.2.4)

1

200 nmol/L

Nước dùng để khuếch đại PCR

Lên đến 40

...

...

...

a Thể tích yêu cầu phụ thuộc vào nồng độ của dung dịch gốc và có thể khác nhau giữa các nhà cung cấp.

7.4.2  Quy trình PCR

7.4.2.1  Khái quát

Chương trình máy chu trình nhiệt trong Bảng 3 được chỉ ra làm ví dụ về việc phát hiện L. pneumophila cách sử dụng các trình tự mồi và đoạn dò được quy định trong 7.3.2.

Chương trình này phải được điều chỉnh theo model và kiểu của máy chu trình nhiệt và phải được đánh giá xác nhận theo các yêu cầu nêu trong Điều 9.

Bảng 3 - Ví dụ về chương trình nhiệt độ và thời gian của PCR

Biến tính ADN và hoạt hoá hot-start Taq polymerase

3 min ở 95 °C

Sao chép ADN

...

...

...

60 s ở 60 °C

Số lượng chu trình

43^a

a Trong bảng này, số chu trình được xác định là điểm chặn của hàm hiệu chuẩn + 3 để có thể quan sát cấu hình khuếch đại thu được 1 GU.

Chương trình phải được thiết lập sao cho trong quá trình sao chép ADN, các tín hiệu huỳnh quang của đoạn dò đặc hiệu L. pneumophila và đoạn dò đặc hiệu đối chứng nội PCR đo được.

CHÚ THÍCH: Thời gian của bước hot-start phụ thuộc vào Taq ADN polymerase được sử dụng cho qPCR và được trong thông số kỹ thuật của máy từ nhà sản xuất.

7.4.2.2  Yêu cầu chung

Sử dụng cách tiếp cận sau đây để phát hiện hoặc định lượng các amplicon.

...

...

...

Dải hiệu chuẩn làm việc (bên ngoài) bao gồm ít nhất bốn mức (ví dụ, các dung dịch ở 25 GU, 250 GU, 2 500 GU và 25 000 GU của L. Pneumophila trên ống phản ứng) được chuẩn bị bằng cách sử dụng dung dịch hiệu chuẩn làm việc (dung dịch bán sẵn hoặc dung dịch được chuẩn bị theo Phụ lục A). Điểm đầu tiên của dải ADN phải bằng giới hạn định lượng LQ_qPCR.

Dung dịch hiệu chuẩn làm việc phải được kết nối với chất chuẩn gốc của ADN Legionella (xem 10.2). Ngày hết hạn của dung dịch này phải được thiết lập về các điều kiện bảo quản theo kế hoạch và được đánh giá xác nhận bằng cách nối với chuẩn gốc.

Ít nhất một lần trong mỗi dãy khuếch đại mẫu (cùng một mẻ thuốc thử PCR, cùng vật liệu), phải phân tích dải hiệu chuẩn làm việc này trong các điều kiện tương tự như được sử dụng đối với mẫu.

Tính ổn định của đường chuẩn và/hoặc việc sử dụng lại dải pha loãng phải được đánh giá xác nhận bằng cách đo mẫu chuẩn sau mỗi lần sử dụng máy chu trình nhiệt (xem 10.3).

7.4.2.3  Định lượng bằng máy real-time

Ngoài thực tế là máy chu trình nhiệt real-time có thể phát hiện tại chỗ các sản phẩm khuếch đại, chúng cũng đặc biệt thích hợp cho PCR định lượng. Các hệ thống phát hiện có thể hạn chế các hiệu ứng plateau bằng cách đo trực tiếp lượng amplicon được tổng hợp trong giai đoạn khuếch đại. Các quá trình này liên quan đến các hệ thống phát hiện và định lượng phát xạ huỳnh quang nhạy. Nguyên tắc hiện đang được sử dụng để hiệu chuẩn là dựa trên việc định lượng amplicon đặc hiệu sử dụng ít nhất một đoạn dò có đánh dấu huỳnh quang bên trong. Việc định lượng dựa trên việc xác định ngưỡng chu trình, C_t, tỷ lệ nghịch với logarit thập phân của số đơn vị gen có mặt ban đầu trong hỗn hợp phản ứng.

Phương pháp xác định C_t được đưa ra làm ví dụ trong Phụ lục B.

Có thể sử dụng các phương pháp toán học khác để xác định C_t. Trong trường hợp này, phương pháp được sử dụng phải được nêu rõ và ảnh hưởng của nó về độ chụm của phép đo phải được kiểm tra phù hợp với quy trình đánh giá đường chuẩn (xem 9.3).

7.5  Phát hiện định tính

...

...

...

Giá trị C_t sẽ được tính đến để xác định sự có mặt của gen đích (Legionella pneumophila hoặc Legionella spp.) mà có thể xác định được nếu có sẵn đường chuẩn với các ngưỡng tín hiệu, có thể sử dụng ngưỡng tín hiệu trung bình (tương ứng với C_t 1 GU xác định được trong 7.4), cao hơn giá trị này thì kết quả có thể được coi là âm tính.

Kết quả PCR có giá trị C_t nằm sau giá trị C_t của điểm chặn b (xem 9.3.4.1) được coi là âm tính.

Việc giải thích định tính có thể được chấp nhận đối với các phương pháp được đánh giá xác nhận là định lượng (bởi chính phòng thí nghiệm hoặc nhà cung cấp).

8  Biểu thị kết quả

Biểu thị kết quả theo Bảng 4 là số lượng đơn vị gen (GU) Legionella spp. và/hoặc L. pneumophila trên lít mẫu (có tính đến thể tích mẫu đã lọc) đến hai con số có nghĩa.

VÍ DỤ 1: 12 312 GU/L Legionella spp. được biểu thị là “12 000 GU/L Legionella spp.”

VÍ DỤ 2: 723 GU/L. pneumophila được biểu thị là “720 GU/L L. Pneumophila”.

Đối với việc biểu thị các kết quả phát hiện định tính, xem Bảng 5.

Bảng 4 - Biểu thị kết quả phát hiện định lượng

...

...

...

N GU/giếng PCR

Dung dịch ADN

Kết quả

GU/L

Nhận xét

N< 1

1

không phát hiện Legionella^a

...

...

...

ADN được pha loãng do có mặt các chất ức chế không phát hiện Legionella^a

1 <N< LQ_qPGR

1

phát hiện Legionella^a dưới giới hạn định lượng

d

Pha loãng ADN do có mặt các chất ức chế phát hiện Legionella^a dưới giới hạn định lượng

...

...

...

1

phát hiện Legionella^a trong giới hạn định lượng

d

Pha loãng ADN do có mặt các chất ức chế phát hiện Legionella^a trong giới hạn định lượng

N > C

0

...

...

...

d

Pha loãng ADN do có mặt các chất ức chế

Legionella^a phát hiện được trên giới hạn định lượng^b

Trong đó:

N là số lượng trung bình GU/giếng PCR;

LD_qpCR là giới hạn phát hiện xác định được trong 9.5;

LQ_qPCR là giới hạn định lượng xác định được trong 9.4;

C là giá trị nằm trên dải hiệu chuẩn xác định được trong 9.3;

...

...

...

d là hệ số pha loãng ADN;

V là thể tích mẫu được lọc, ml;

a là chi đích nêu rõ Legionella spp. hoặc L. pneumophila;

b trong trường hợp này, có thể định lượng được sau khi pha loãng ADN.

Bảng 5 - Biểu thị kết quả phát hiện định lượng

Số lượng

N GU/giếng PCR

Dung dịch ADN

...

...

...

GU/L

Nhận xét

N < 1

1

không phát hiện được Legionella^a

d

Pha loãng ADN do có mặt các chất ức chế không phát hiện được Legionella^a

...

...

...

1

không phát hiện được Legionella^a

d

không phát hiện được Legionella^a

Trong đó:

N là số lượng trung bình GU/giếng PCR;

LD_qPCR là giới hạn phát hiện xác định được trong 9.5;

...

...

...

d là hệ số pha loãng ADN;

V là thể tích mẫu được lọc, ml;

a là chi đích nêu rõ Legionella spp. hoặc L. pneumophila;

b trong trường hợp này, có thể định lượng được sau khi pha loãng ADN.

9  Quy trình kỹ thuật để xác định đặc tính và đánh giá xác nhận phương pháp

9.1  Yêu cầu chung

Các tiêu chí kỹ thuật và các yêu cầu nêu trong điều này phải được sử dụng để xác định đặc tính kỹ thuật và đánh giá xác nhận (nội bộ/bên thứ ba hoặc ban đầu/thứ cấp) của tất cả các phương pháp được xây dựng mới hoặc sửa đổi (ví dụ: thay đổi bộ kit PCR, thay đổi phương pháp tinh sạch, thay đổi thành phần của bộ kit).

Mọi quy trình ứng dụng thông thường cũng phải được đánh giá xác nhận theo các yêu cầu được nêu chi tiết trong Điều 9 này.

Đối với các phương pháp thương mại đã được đánh giá xác nhận của bên thứ ba đáp ứng các yêu cầu nêu trong Điều 9, thì phải tuân thủ hoàn toàn các hướng dẫn của nhà sản xuất.

...

...

...

Các phòng thử nghiệm chỉ sử dụng phương pháp phát hiện định tính thì phải đáp ứng các yêu cầu trong Điều 9, trừ 9.3 và 9.4.

9.2  Tính toàn diện và tính loại trừ của các đoạn dò và mồi

Mồi và mẫu dò được sử dụng phải cho các kết quả mong đợi đối với các loài và các nhóm huyết thanh dưới đây mà tất cả đã được phân lập trong môi trường hoặc từ trường hợp mẫu bệnh của người.

Các phép thử về tính toàn diện và tính loại trừ phải được thực hiện trên tất cả các loài được liệt kê dưới đây. Các dịch tách chiết ADN phải được lấy một phần từ WDCM và/hoặc các chủng sưu tập quốc gia và một phần từ các chủng môi trường. Tất cả các chủng môi trường được phân tích như một phần của việc đánh giá xác nhận này phải được lập thành văn bản bao gồm cả phương pháp thay thế được sử dụng để xác định chủng Legionella.

- Các phép thử tính bao gồm được thực hiện trên dịch chiết ADN có chứa khoảng 100 GU/giếng PCR. Liều thêm chuẩn này tránh cho kết quả dương tính giả.

- Các phép thử tính không bao gồm được thực hiện trên dịch chiết ADN có chứa ít nhất 10 000 GU/giếng PCR. Liều thêm chuẩn này tránh cho kết quả âm tính giả.

Nồng độ huyền phù vi khuẩn có thể được ước tính sử dụng mật độ quang của huyền phù ở 600 nm. (Mật độ quang 0,5 ở 600 nm tương ứng với 10⁹ CFU/mL).

- Danh mục kiểm tra tính bao gồm (vi sinh vật để kiểm tra phương pháp Legionella spp.): L. anisa (ví dụ: WDCM 00106), L. birminghamensis, L. bozemanii 1 và 2, L. cherrii, L. cincinnattensis (ví dụ: CIP 103875), L. dumoffii, L. erythra 2, L. feeleii 7 và 2, L. gormanii, L. hackeliae serogroup1 (ví dụ CIP 103844) và serogroup 2, L. jordanis, L. lonsingensis (ví dụ ATCC 43751), L. longbeachae 1 và 2, L. maceachemii, L. micdadei (ví dụ ATCC 33218), L. oackridgensis, L. parisiensis (ví dụ CIP 103847), L. pneumophila serogroup1 đến 15 (ví dụ: Legionella pneumophila serogroup1 WDCM 00107; Legionella pneumonia serogroup6 ATCC 33215), L. sainthelensi 1 và 2, L. tucsonensis, L. wadsworthii (ví dụ CIP 103886).

- Danh mục kiểm tra tính bao gồm (vi sinh vật để kiểm tra phương pháp L. Pneumophila): 15 serogroup từ các loài.

...

...

...

- Danh mục kiểm tra tính không bao gồm (các vi sinh vật được thử nghiệm được công nhận là không thuộc loài L. Pneumophila): L. anisa (ví dụ: WDCM 00106), L. bozemanii, L. dunmofii, L. gormanii, L. jordanis, L. longbeachae, L. micdade (ví dụ: ATCC 33218)i, L. parisiensis (ví dụ CIP 103847), L. tucsonensis.

Tất cả các chủng được phân tích như một phần của việc đánh giá xác nhận này phải được lập thành văn bản kể cả phương pháp thay thế được sử dụng để xác định chủng là Legionella.

9.3  Kiểm tra hàm hiệu chuẩn của giai đoạn PCR định lượng

9.3.1  Yêu cầu chung

Việc hiệu chuẩn không thể dễ dàng áp dụng cho toàn bộ phương pháp. Chỉ hiệu chuẩn định lượng bằng PCR real-time (trên dải ADN) được mô tả sau đây. Điều này không loại trừ khả năng áp dụng các quy tắc đặc tính hàm hiệu chuẩn tương tự cho toàn bộ phương pháp, tức là các mẫu nước được làm nhiễm nhân tạo.

Hàm hiệu chuẩn phải được thực hiện với cả hai hệ thống PCR, tức là Legionella spp. và L. pneumophila.

Đối với phân tích thống kê, nồng độ của các đơn vị gen trên mỗi giếng PCR được biểu thị dưới dạng logarit thập phân.

9.3.2  Nguyên tắc xác nhận đường chuẩn

Kinh nghiệm cho thấy rằng các giá trị C_t trung bình thu được đối với các mức khác nhau của đại lượng đơn vị gen (được biểu thị bằng logarit thập phân) có thể được thể hiện theo mô hình hồi quy tuyến tính, tức là bằng công thức tuyến tính là y = ax'+ b.

...

...

...

Các thông số của đường chuẩn được xác định ban đầu theo quy trình đánh giá trong 9.3.3. Sau đó phân tích thống kê (xem 9.3.4) để:

a) Xác định công thức của đường chuẩn (xem 9.3.4.1);

b) Xác nhận mô hình hồi quy tuyến tính (xem 9.3.4.3).

9.3.3  Quy trình đánh giá đường chuẩn

Việc đánh giá các tính năng hiệu chuẩn phải được thực hiện trong các điều kiện độ chụm trung bình (ít nhất là vào các ngày khác nhau và/hoặc với những người khác nhau thực hiện) (ví dụ: từng ngày cho gia đoạn 5 ngày).

Chuẩn bị một dãy các mức p nồng độ của các đơn vị gen L. pneumophila [tốt nhất là được chuẩn bị từ chất chuẩn ban đầu và trong mọi trường hợp, được chuẩn bị từ L. Pneumophila (WDCM 00107)], p ít nhất bằng 4, ví dụ, 25, 250, 2500, 25000 đơn vị gen L. pneumophila trên mỗi giếng PCR. Điểm đầu tiên của dải phải bằng giới hạn định lượng (xem 9.4). Ở mỗi mức thực hiện k lần lặp lại phép đo, k ít nhất bằng 5. Ghi lại các giá trị y_i,j thu được theo ví dụ nêu trong Bảng 6.

Thực hiện các phép tính như trong Bảng 6.

Bảng 6 - Định dạng kết quả và tính toán

Mức x_i

...

...

...

x₂ = 10 LQ_PCR

x₃ = 100 LQ_PCR

x₄ = 1000 LQ_PCR

x_p

Tổng số

x’₁

x’₂

x’₃

...

...

...

x’_p

y_i,j

(k lần lặp lại)

y_1,1

y_2,1

y_3,1

y_4,1

y_p,1

...

...

...

y_1,2

y_2,2

y_3,2

y_4,2

y_p,2

y_1,k

y_2,k

y_3,k

...

...

...

y_p,k

T₁

T₂

T₃

T₄

T_p

...

...

...

m₁

m₂

m₃

m₄

m_p

...

...

...

x_i là số đơn vị gen L. pneumophila trên mỗi giếng PCR (các giá trị x_i của các mức đưa ra là các ví dụ)

x’_i là logarit của x_i;

y_i,j là phép đo giá trị C_t ở mức i (i = 1…p) và hàng j (j = 1...k);

k là số lần lặp lại trên mỗi mức i (k ≥ 5);

p là số mức (P ≥ 4).

Tính tổng số các phép đo là N theo công thức (1):

...

...

...

Xem Phụ lục C để biết ví dụ tính toán đầy đủ.

9.3.4  Phân tích kết quả

9.3.4.1  Ước lượng đường hồi quy

Đường hồi quy được tính theo Công thức (2):

trong đó , là giá trị C_t trung bình.

Vẽ các điểm có tọa độ (x’₁, m₁), (x’_p, m_p) trên đồ thị để xác nhận quan sát sự thẳng hàng của chúng dọc theo đường cong. Nếu kết quả kiểm tra này đạt yêu cầu, thì chuyển sang Công thức (3) và (4):

...

...

...

và phương sai của x’y, σ_x’y, theo Công thức (6):

Ước tính độ dốc a theo Công thức (7):

Thực hiện các phép tính sau để cố định điểm cắt b.

Đường cong đi qua điểm trung bình có tọa độ trên trục hoành

Và trên trục tung

...

...

...

Dẫn đến

Và do đó:

9.3.4.2  Ước tính và xác nhận hiệu quả khuyếch đại

Hiệu suất đánh giá năng suất của phản ứng PCR.

Hiệu suất, e, được tính bằng Công thức (8):

Hiệu suất phải có giá trị trong khoảng từ 75 % đến 125 %. Do đó, giá trị của độ dốc, a, phải nằm trong khoảng -4,115 đến -2,839. Khoảng chấp nhận này đủ lớn để bao gồm tất cả các hệ thống qPCR trên tất cả các máy chu trình nhiệt. Đối với hệ thống qPCR xác định trên một máy chu trình nhiệt thường được sử dụng, thì giới hạn chấp nhận phải được ước tính theo phương pháp kiểm soát chất lượng sử dụng nghiên cứu thống kê hoặc biểu đồ chất lượng.

...

...

...

9.3.4.3  Xác nhận hiệu năng hồi quy tuyến tính

Hồi quy tuyến tính phải thỏa mãn yêu cầu về độ chính xác sau đây đối với từng nồng độ của đường chuẩn (tiêu chí bao gồm độ chệch và độ chụm) như được chỉ ra trong Công thức (9):

E_lin ≤ 0,15                            (9)

trong đó E_lin là độ chính xác của tuyến tính, được biểu thị dưới dạng lôgarit thập phân.

Để thực hiện việc này, thực hiện các phép tính nêu trong Bảng 7.

Nếu E_lini ≤ 0,15, bất kể mức i nào, thì độ tuyến tính phải được xác nhận.

Nếu một trong các giá trị E_lini nằm trên giá trị tới hạn của 0,15log₁₀, thì mô hình không được xác nhận.

CHÚ THÍCH: Việc kiểm tra các giá trị độ chệch và độ lệch chuẩn cho thấy lỗi mô hình là do vấn đề độ chính xác (s’_i quá cao) hoặc vấn đề độ chệch ( , quá cao) gây ra.

Bảng 7 - Độ chệch, độ chụm, độ chính xác và độ không đảm bảo của các phép tính tuyến tính

...

...

...

x₁

x₂

x₃

x₄

x_p

Mức x’_i lý thuyết

x’₁

x’₂

x’₃

...

...

...

x’_p

x’_i,j

x’_1,1

x’_2,1

x’_3,1

x’_4,1

x’_P,1

x’_1,2

x’_2,2

...

...

...

x’_4,2

x’_p,2

x’_1,3

x’_2,3

x’_3,3

x’_4,3

x’_p,3

x’_1,4

x’_2,4

...

...

...

x’_4,4

x’_p,4

x’_1,k

x’_2,k

x’_3,k

x’_4,k

x’_p,k

...

...

...

Độ chệch

...

...

...

s’₁

s’₂

s’₃

s’₄

s’_p

E_lin1

E_lin2

E_lin3

...

...

...

E_linp

U_{lin i} = E_{lin i} t_{k - 2}

U_lin1

U_lin2

U_lin3

U_lin4

U_linp

Theo lý thuyết

x’_i là giá trị tính được sử dụng công thức: x’_i = log x’_i;

...

...

...

 là giá trị trung bình của x’_i;

s’_i, là độ lệch chuẩn của các giá trị x’_i,j  với k-1 bậc tự do;

E_lin là độ chính xác của độ tuyến tính;

U_lin là độ không đảm bảo mở rộng của độ tuyến tính;

t_k-2 là giá trị được cho bởi bảng Student cho k - 2 bậc tự do ở rủi ro 5 % (xem Phụ lục D).

9.3.5  Sử dụng đường chuẩn

Đối với mỗi phép đo y = C_t của mẫu, sử dụng công thức đường chuẩn, như trong Công thức (10), để thu được x' bằng cách hiệu chuẩn ngược:

trong đó các giá trị k của x’ thu được nếu lấy k các phép đo riêng biệt trên cùng một mẫu.

...

...

...

CHÚ THÍCH: Nếu độ lệch chuẩn liên quan, s’, lớn hơn 0,15, thì độ không đảm bảo của phép đo mẫu là lớn hơn độ không đảm bảo ước tính được trong quá trình xác định đặc tính của phương pháp ban đầu.

Bằng phép biến đổi antilog, biểu thị kết quả dưới dạng là x GU/lít theo Công thức (11):

9.4  Xác nhận giới hạn định lượng PCR, LQ_qPGR

9.4.1  Nguyên tắc

Giới hạn định lượng thấp nhất có thể chấp nhận được là 25 GU (1,40log10 đơn vị) do phân bố lấy mẫu (phân phối Poisson) trên tất cả các thử nghiệm được thực hiện trên mẫu.

Giới hạn định lượng phải tương ứng với mức đầu tiên của dải hiệu chuẩn.

Giới hạn định lượng được xác nhận nếu thiếu độ chính xác ở giới hạn định lượng, E_LQ, nhỏ hơn hoặc bằng giá trị tới hạn của 0,15log10 đơn vị.

CHÚ THÍCH: Giá trị 0,15lg10 đơn vị có được từ dữ liệu thực nghiệm.

...

...

...

Chuẩn bị k dung dịch pha loãng riêng biệt (k ≥ 10) tại giá trị LQ_qPCR mục tiêu từ dung dịch ADN của L. pneumophila thu được từ chất chuẩn gốc (xem 10.2). Định lượng từng độ pha loãng theo quy trình phòng thí nghiệm thông thường (đơn, lặp lại hai lần hoặc lặp lại ba lần) trong các điều kiện độ chụm trung gian này (ít nhất vào các ngày khác nhau và/hoặc do những người khác nhau thực hiện). Giá trị LQ_qPCR mục tiêu không được nhỏ hơn 25 GU cho một phép đo đơn lẻ, 15 GU cho phép đo lặp lại hai lần và 10 GU cho phép đo lặp lại ba lần.

9.4.3  Phân tích kết quả

Tính độ lệch chuẩn đối với các giá trị x’_i thu được thông qua hiệu chuẩn ngược từ k phép đo như trong Công thức (12)

Trong đó

x’_i là logarit thập phân của số đơn vị gen của L. Pneumophila, được tính bằng hiệu chuẩn ngược, từ các giá trị C_t và công thức đường chuẩn;

k là số lần đo.

Tính toán độ chệch theo Công thức (13):

...

...

...

Tính độ chính xác ở giới hạn định lượng, E_LQ, theo Công thức (14):

Trong đó:

E_LQ là độ chính xác ở giới hạn định lượng;

s là độ lệch chuẩn của các giá trị x’_i thu được từ k lần đo.

Nếu E_LQ ≤ 0,15, thì giới hạn định lượng đích cần được xác nhận. Nếu không, cần tìm nguyên nhân (giá trị tháp, các số lạc v.v...).

Tính độ không đảm bảo ở giới hạn định lượng (U_LQ) sử dụng Công thức (15):

U_LQ = E_LQt_tab            (15)

Trong đó:

...

...

...

T_tab là giá trị bảng student (với rủi ro 5 %, đối với k - 1 bậc tự do).

Ví dụ về xác nhận LQ_qPCR đối với LQ_qPCR mục tiêu ở 25 GU, với 10 phép đo được nêu trong Bảng 8.

Bảng 8 - Ví dụ về xác nhận LQ_qPCR

Phép thử số

x’_i

1

1,498

2

1,577

...

...

...

1,461

4

1,48

5

1,515

6

1,531

7

1,422

...

...

...

1,442

9

1,547

10

1,499

1,497

Độ chệch

0,099

...

...

...

0,048

E_LQ

0,110

U_LQ

0,249

Trong ví dụ ở Bảng 8 E_LQ = 0,11, do đó E_LQ ≤ 0,15 và giới hạn định lượng ở 25 GU được xác nhận.

9.4.4  Giới hạn định lượng lý thuyết của toàn bộ phương pháp

LQ lý thuyết của phương pháp hoặc LQ_meth (biểu thị bằng đơn vị gen trên lít) thu được bằng cách sử dụng Công thức (16):

...

...

...

F là hệ số chuyển đổi số đơn vị gen trên một giếng sang số đơn vị gen trên lít;

V là thể tích mẫu đã lọc.

CHÚ THÍCH: LQ_meth này không tính đến sự phục hồi vốn có của các giai đoạn chuẩn bị.

9.5  Đánh giá xác nhận giới hạn phát hiện PCR (LD_qPCR)

Giới hạn phát hiện tương ứng với số lượng đơn vị gen nhỏ nhất cho kết quả PCR dương tính ở ngưỡng 90 %.

Kiểm tra để đảm bảo rằng ít nhất 90 % giá trị LQ_qPCR mục tiêu là dương tính (ví dụ: 5 GU/giếng PCR) để hạn chế số lần thử nghiệm. Thực hiện ít nhất 10 phép đo đối với LQ_qPCR được chọn từ 10 dung dịch pha loãng riêng biệt được chuẩn bị từ dung dịch ADN L. Pneumophila được nối với chuẩn gốc (xem 10.2).

9.6  Phương pháp xác định độ thu hồi

9.6.1  Nguyên tắc

Nghiên cứu thu hồi phải được thực hiện trên các mẫu nước không chứa ADNse/RNAse (không có ADN Legionella) đã được gây nhiễm nhân tạo bằng các dung dịch pha loãng của huyền phù gốc được hình thành từ chủng L. Pneumophila (WDCM 00107).

...

...

...

Đối với mỗi mức nồng độ, phải phân tích ít nhất 10 mẫu thêm chuẩn riêng rẽ với lượng từ 100 ml đến 1 L trong các điều kiện độ chụm trung gian (trong vài ngày, do những kỹ thuật viên khác nhau thực hiện, v.v...).

Tính độ thu hồi theo hiệu số logarit. Độ thu hồi phải nằm trong khoảng từ -0,6log10 đơn vị đến + 0,3log₁₀ đơn vị.

9.6.2  Quy trình

Để thực hiện một loạt các phép thử, tạo huyền phù gốc từ các khuẩn lạc L. Pneumophila (WDCM 00107), sau đó cấy vô trùng các khuẩn lạc L. pneumophila (ví dụ: 5 khuẩn lạc), đã phát triển trong khoảng thời gian dưới 72 h, trong ống chứa 2 ml muối trypton để thu được huyền phù gốc (mẹ) về mặt lý thuyết chứa 10⁹ GU/mL. Nên xác nhận nồng độ của huyền phù mẹ bằng cách đo mật độ quang ở 600 nm. Mật độ quang là 0,5 ở 600 nm tương ứng với nồng độ Legionella spp. là 10⁹ sinh vật/mL. Đồng hóa mạnh huyền phù mẹ để ít nhất 30 s.

Đo nồng độ các đơn vị gen trong huyền phù mẹ bằng PCR từ ba dịch phân giải trực tiếp của huyền phù mẹ: áp dụng đồng thời quy trình ly trích của phương pháp (dung dịch phân giải và các điều kiện vật lý như nhiệt độ, thời gian, lắc trộn) cho ba phần mẫu thử của huyền phù gốc. Thể tích phần mẫu thử tối thiểu là 100 μL được đưa vào thể tích chuẩn của dung dịch phân giải (tỷ lệ giữa thể tích của dung dịch phân giải và thể tích phần mẫu thử phải ít nhất là 3). Khi kết thúc quá trình phân giải, thu được ba dịch chiết ADN chưa được tinh sạch, nếu cần, được pha loãng để loại bỏ mọi sự ức chế PCR liên quan đến thuốc thử phân giải và sau đó, được định lượng bằng PCR.

Cách khác để tạo ra huyền phù của vi khuẩn Legionella pneumophila cho các thực nghiệm xác định độ thu hồi là sử dụng các mẫu chuẩn có bán sẵn trên thị trường với một lượng đã được chứng nhận (được biểu thị bằng GU) Legionella pneumophila.

Tính giá trị trung bình, A, được biểu thị bằng logarit thập phân GU/ml, từ ba giá trị logarit thu được. Giá trị A này được tham chiếu cho phép tính độ thu hồi.

Đồng thời tạo ra các huyền phù thêm chuẩn từ huyền phù mẹ, để thu được các mức nồng độ mục tiêu, tức là chuẩn bị một dải các dung dịch pha loãng từ huyền phù mẹ (ví dụ: 10^-1, 10^-2, 10^-3, 10^-4 và 10^-5 được ký hiệu là d₁, d₂, d₃, d₄ và d₅). Dãy pha loãng phải được thực hiện ở độ pha loãng 10^-1 trong muối trypton, 9 mL muối trypton được cho vào 1 mL huyền phù vi khuẩn. Mỗi ống phải được đồng nhất bằng cách lắc cơ học (khoảng 10 s). Các mức pha loãng 10^-3 (d₃) và 10^-5 (d₅) tương ứng với khoảng 106 GU/ml và 104 GU/mL. Chuẩn bị hai mẫu thêm chuẩn bằng cách cấy một thể tích tối thiểu là 100 μL (được ký hiệu là V_pe), của hai độ pha loãng đã chọn, ví dụ d₃ hoặc d₅, có thể thu được các lượng tương ứng của 10⁵ GU và 10³ GU trong một thể tích đã lọc (0,1 L đến 1 L), trong trường hợp này. Hai mẫu thêm chuẩn thu được này (hai mức khác nhau) phải tuân theo quy trình đo đầy đủ (lọc, chiết và đo) và phải cho kết quả B, được biểu thị dưới dạng logarit thập phân trên mỗi mẫu.

Việc định lượng PCR của huyền phù mẹ và các mẫu đã được thêm chuẩn phải được thực hiện trong cùng một ngày, trong cùng một dãy khuếch đại.

...

...

...

Tính toán độ thu hồi của mẫu được tính theo Công thức (17):

Trong đó:

log₁₀η_x là logarit thập phân của độ thu hồi mẫu;

A là giá trị tham chiếu của nồng độ huyền phù gốc (mẹ), được biểu thị bằng logarit thập phân của số đơn vị gen trên mililít;

V_pe là thể tích của huyền phù thêm chuẩn, tính bằng microlit, μL;

B là giá trị được đo từ mẫu thêm chuẩn, được biểu thị bằng logarit thập phân của số đơn vị gen trên mỗi mẫu;

D là logarit thập phân của hệ số pha loãng giữa huyền phù mẹ và huyền phù thêm chuẩn, ví dụ: D là 3 đối với độ pha loãng 10^-3.

Quy trình được mô tả ở trên phải được thực hiện ít nhất 10 lần đối với mỗi mức thêm chuẩn trong các điều kiện độ chụm trung gian (ít nhất vào các ngày khác nhau và/hoặc do những người khác nhau thực hiện). Tính độ thu hồi trung bình và độ lệch chuẩn từ 10 giá trị độ thu hồi riêng lẻ thu được.

...

...

...

Các giá trị này có thể là các giá trị đầu tiên được sử dụng vào các biểu đồ kiểm soát.

Nếu giá trị thu được không nằm trong giới hạn dự kiến thì phải điều tra nguyên nhân.

Xem ví dụ trong Phụ lục E.

9.7  Độ vững

Trong trường hợp này, độ vững được xác định thông qua đặc tính của hiệu ứng nền. Độ thu hồi về cơ bản không bị ảnh hưởng bởi loại nền mẫu cần phân tích.

Để thực hiện điều này, ước tính độ thu hồi của từng loại nền mẫu (ví dụ: nước từ tháp làm mát, nước ăn uống, nước mặt, nước thải) và theo dõi theo thời gian (biểu đồ kiểm soát tùy chọn). Thực hiện theo quy trình trong 9.6, bằng cách thay nước vô trùng bằng nền mẫu không chứa L. pneumophila (thể tích lọc tối thiểu phải là 100 mL). Các giới hạn chấp nhận được giống như các giới hạn nêu trong 9.6.

9.8  Độ không đảm bảo tổng thể của phương pháp

Phép đo độ không đảm bảo tổng thể của phương pháp bao gồm cả độ chính xác và độ chụm trung bình.

Cách tiếp cận nêu trong tiêu chuẩn này dựa trên việc phân tích các giá trị độ thu hồi.

...

...

...

Chỉ độ thu hồi phân giải không được đưa vào đánh giá độ không đảm bảo. Khuyến cáo rằng quy trình ly trích trong phòng thí nghiệm được so sánh với các quy trình ly trích thương mại khác nhau để kiểm tra sự thiếu sót của giai đoạn này.

Phép đo độ thu hồi thu được từ hai phép đo PCR (phương pháp tổng thể và phương pháp phân giải trực tiếp). Đánh giá độ không đảm bảo do đó được đánh giá quá cao.

Tiến hành các phép tính nêu trong Bảng 9 (xem ví dụ trong Bảng F.1, Phụ lục F).

Bảng 9 - Tính độ không đảm bảo từ các giá trị độ thu hồi

Mẫu số.

Nền mẫu

Mức thử nghiệm

Độ thu hồi mẫu

x = 1…n

...

...

...

Nước tinh khiết

Mức 1 (ví dụ 1 000 GU/L)

η_x

Mức 2

Nước nóng làm vệ sinh

Mức 1

Mức 2

Nước từ tháp làm mát

Mức 1

...

...

...

v.v...

Mức 1

Mức 2

Độ thu hồi trung bình

Phương sai (s²)

Độ không không đảm bảo đo mở rộng tổng thể, U_overall

...

...

...

10  Kiểm soát chất lượng

10.1  Yêu cầu chung

Kiểm soát chất lượng đảm bảo tính đúng và chính xác của các phép đo do phòng thí nghiệm thực hiện. Các tần số đã nêu của các phép kiểm soát là tần số tối thiểu cần thiết khi thiết lập các kỹ thuật này. Việc tích lũy các kết quả có thể cho phép sửa đổi các tần số này.

Trong trường hợp phát hiện định tính, tất cả các kiểm soát chất lượng phải được thực hiện, trừ các kiểm soát nêu trong 10.2 và 10.3.

10.2  Liên kết dung dịch hiệu chuẩn và chất chuẩn với chuẩn gốc (chuẩn chính)

10.2.1  Nguyên tắc

Tính đúng của phép đo PCR real-time được đảm bảo bởi ba cấp chuẩn

a) Chuẩn gốc;

b) Các dung dịch hiệu chuẩn làm việc được sử dụng với mỗi loạt khuếch đại;

...

...

...

Các dung dịch hiệu chuẩn làm việc (có hoặc không được cung cấp trong bộ kit thương mại) phải được nối với chất chuẩn gốc ít nhất mỗi năm một lần. Ngoài ra, nhà sản xuất bộ kít thương mại hoặc phòng thí nghiệm thiết kế phải thực hiện việc nối chuẩn này trong khi thực hiện các thay đổi đối với các dung dịch hiệu chuẩn.

Mẫu chuẩn phải được kết nối với chuẩn gốc (chính) và được lưu trữ trong các điều kiện đã được xác nhận để đảm bảo tính đồng nhất và ổn định của chúng. Mẫu chuẩn [dung dịch ADN L. Pneumophila (WDCM 00107)] được kết nối với chuẩn gốc, được sử dụng mà không cần pha loãng, có sẵn từ trung tâm chuẩn legionella quốc gia của Pháp.

10.2.2  Quy trình

Để thực hiện kết nối, dung dịch chuẩn làm việc phải được hiệu chuẩn với chất chuẩn gốc như sau.

Từ dung dịch hiệu chuẩn làm việc cần được kết nối, chuẩn bị ít nhất ba dải độc lập với bốn mức (tối thiểu) bằng các dung dịch pha loãng nối tiếp, bao trùm dải định lượng tuyến tính, trong dung dịch được sử dụng để phân tích mẫu trắng PCR. Thực hiện tương tự với chuẩn gốc. Các mức mục tiêu đối với hai dung dịch này phải tương đương nhau. Hai dãy này ba dải ADN độc lập phải được phân tích trong cùng một dãy PCR.

10.2.3  Phân tích dữ liệu

a) Xác nhận sự tương đương của các độ dốc (hiệu quả PCR).

Bằng hồi quy tuyến tính, thiết lập hàm hiệu chuẩn sử dụng các giá trị thu được đối với dải hiệu chuẩn của chuẩn gốc (được gọi là dải tham chiếu). Kiểm tra xác nhận rằng độ dốc a nằm trong khoảng từ -4,115 đến -2,839 tương ứng với hiệu suất khuếch đại với giá trị từ 75 % đến 125 % (xem 10.3).

Bằng cách hiệu chuẩn ngược, tính lại các giá trị đơn vị gen logarit thập phân với các giá trị C_t thu được, sử dụng hàm hiệu chuẩn đối với mỗi mức của dải hiệu chuẩn làm việc. Đối với mỗi cấp, tính độ lệch giữa giá trị mong đợi và giá trị được tính toán lại.Tính giá trị tuyệt đối của chênh lệch giữa giá trị tại điểm cao nhất và điểm thấp nhất.

...

...

...

Nếu giá trị này nhỏ hơn hoặc bằng 0,20 thì hiệu quả là tương đương.

b) Điều chỉnh lại dung dịch hiệu chuẩn làm việc

Nếu các độ dốc là tương đương, thì tính giá trị trung binh của các độ lệch.

Nếu giá trị tuyệt đối của giá trị trung bình này lớn hơn 0,20 thì chuẩn bị dung dịch hiệu chuẩn chính xác khác (độ chệch bằng không) bằng cách pha loãng từ dung dịch gốc.

Nếu không, không cần chỉnh sửa. Kết nối đã đạt được.

Tiến hành theo cách tương tự để đánh giá giá trị của mẫu chuẩn hoặc sử dụng mẫu chuẩn có sẵn từ trung tâm chuẩn legionella quốc gia.

Ví dụ về kết nối của dung dịch hiệu chuẩn làm việc với chất chuẩn gốc được nêu trong Bảng 10.

c) Kiểm tra xác nhận sự tương đương của các độ dốc (hiệu quả PCR):

...

...

...

d) Chỉnh lại dung dịch hiệu chuẩn làm việc.

Sai số hiệu chuẩn trung bình nhỏ hơn 0,20log₁₀, không cần hiệu chỉnh lại hiệu chuẩn đối với dung dịch hiệu chuẩn.

CHÚ THÍCH: Việc nối chuẩn của dung dịch hiệu chuẩn không thể ngoại suy theo phần dưới hoặc phần trên dải chuẩn được thiết lập bằng dung dịch chuẩn gốc.

Bảng 10 - Ví dụ về kết nối của dung dịch hiệu chuẩn làm việc với chất chuẩn gốc

Dải chuẩn

Mức thử nghiệm

Log₁₀(GU)

C_ts (chu trình) thu được

...

...

...

33,33

34,90

34,68

Log₁₀(250)

31,64

31,05

31,18

Log₁₀(2500)

27,92

...

...

...

27,80

Log₁₀(25000)

24,64

24,71

24,60

Độ dốc

-3,31

Điểm chặn

39,10

...

...

...

Mức ước tính

log₁₀(GU)

C_ts (chu trình) thu được

C_t trung bình trên mức

Số lượng thu được trên mức

Sai số hiệu chuẩn trên mức

log₁₀(25)

34,55

34,34

...

...

...

34,50

1,39

-0,01

log₁₀(250)

31,07

30,92

30,80

30,93

2,47

...

...

...

log₁₀(2500)

27,02

27,70

27,73

27,48

3,51

0,11

log₁₀(25000)

24,23

...

...

...

24,52

24,42

4,43

0,03

Sai số hiệu chuẩn trung bình

0,05

10.3  Theo dõi hiệu năng

10.3.1  Hiệu năng của việc hiệu chuẩn

Những nội dung sau đây phải được theo dõi:

...

...

...

- giá trị của mẫu chuẩn (được định lượng bằng hiệu chuẩn ngược).

Giá trị tính toán phải tương ứng với giá trị tham chiếu ± 0,4 log₁₀ đơn vị.

Kiểm soát này, được biểu thị bằng logarit thập phân của các đơn vị gen, phải được theo dõi theo thời gian (biểu đồ kiểm soát).

10.3.2  Theo dõi hiệu năng ở giới hạn định lượng

Đối với mỗi lần hiệu chuẩn: cần theo dõi độ lệch chuẩn tại điểm đầu tiên của đường chuẩn (LQ_PCR). Giá trị tuyệt đối của độ lệch phải nhỏ hơn 2 x 0,15. Các phòng thí nghiệm có thể siết chặt các giới hạn thiết lập bằng cách tăng số các điểm của dải.

10.4  Đối chứng dương tính và đối chứng âm tính của phương pháp

Đối với phép đối chứng dương tính, thực hiện đánh giá độ thu hồi ít nhất mỗi tháng một lần theo 9.6. Đối chứng dương tính định lượng này được sử dụng để theo dõi theo thời gian (sử dụng biểu đồ kiểm soát) độ thu hồi của phương pháp, được xác định ban đầu trong giai đoạn đánh giá hiệu năng (xem 9.6).

Việc đối chứng âm tính của phương pháp được thực hiện theo quy trình hoàn chỉnh trên thể tích mẫu từ 100 ml đến 1 L nước vô trùng không chứa ADN legionella. Việc đối chứng này phải được thực hiện sau mỗi dãy lọc. Mẫu đối chứng âm tính phải là mẫu cuối cùng sau khi lọc tất cả các mẫu khác trong dãy. Phép đối chứng âm tính của phương pháp được sử dụng để theo dõi toàn bộ quá trình (từ lọc đến tách chiết đến qPCR).

Đối với các phương pháp đã được bên thứ ba đánh giấc nhận đầy đủ, phải tuân thủ các hướng dẫn của nhà sản xuất về giải thích các đối chứng dương tính hoặc âm tính và NTC (xem 10.5).

...

...

...

10.5  Đối chứng không mẫu (NTC)

Đối với mỗi lần chạy khuếch đại PCR mẫu, chuẩn bị NTC để xác nhận rằng không có sự nhiễm ADN trong quá trình chạy PCR.

Đối chứng âm tính (10.4) có thể được sử dụng cho mục đích đó. Tuy nhiên, việc chuẩn bị mẫu trắng cụ thể cho bước PCR có thể được sử dụng để phát hiện sự nhiễm ở giai đoạn này. Điều này tránh việc điều tra không cần thiết đối với toàn bộ phương pháp nếu kết quả là dương tính.

Mẫu trắng dương tính chứng tỏ có sự ô nhiễm và phải đánh giá xác nhận đặc biệt về phép thử.

NTC có giá trị C_t lớn hơn giá trị C_t của điểm chặn thì không được coi là dương tính.

10.6  Kiểm soát ức chế

10.6.1  Yêu cầu chung

Điều cần thiết là phải đánh giá sự có mặt của chất ức chế PCR trong dịch chiết ADN.

Chất kiểm soát ức chế phải được bổ sung vào dịch chiết mẫu. Chất kiểm soát ức chế này có thể là chính chất đích (xem 10.6.2), hoặc plasmid hoặc oligonucleotit (xem 10.6.3).

...

...

...

Thử nghiệm ít nhất một giếng với dịch chiết tử mẫu, một giếng kiểm soát ức chế PCR đơn thuần [2] và một giếng với dịch chiết mẫu và kiểm soát ức chế PCR [3].

Đường kiểm soát ức chế PCR là đường thu được với hỗn hợp phản ứng (6.5.2) mà trong đó một lượng ADN đích đã biết đã được thêm vào.

Thử nghiệm về sự có mặt của chất ức chế bao gồm so sánh đường cong của dịch chiết mẫu được thêm trình tự mục tiêu và đối chứng được thêm trình tự mục tiêu

Nếu các độ dốc không song song, có thể xảy ra sự ức chế. Pha loãng dịch chiết ADN mẫu để xác nhận có ức chế.

Nếu các độ dốc (tức là độ dốc của các tiếp tuyến với C_t) song song, thì thực hiện giải thích theo Bảng 11.

Bảng 11 - Diễn giải kiểm soát ức chế khi sự kiểm soát đó là chất cần kiểm tra

Dịch chiết mẫu

(1)

Đối chứng

...

...

...

Dịch chiết mẫu + kiểm chứng (3) so với đối chứng (2)

Giải thích

C_t,1

C_t,2

C_t,3 ≤ C_t,3

Có mặt ADN Legionella spp. hoặc Legionella pneumophila

C_t,1

C_t,2

C_t,3 > C_t,3

...

...

...

Không khếch đại

C_t,2

C_t,3 = C_t,2

Không có ADN Legionella spp. hoặc Legionella pneumophila ở ngưỡng phát hiện của phương pháp

Không khếch đại

C_t,2

C_t,3 > C_t,2

Ức chế, dịch chiết ADN mẫu được pha loãng cho đến khi các giá trị C_t thu được thống nhất với liều lượng bổ sung

C_t,1 Ngưỡng chu trình trong giếng chỉ có dịch chiết mẫu

...

...

...

C_t,3 Ngưỡng chu trình trong giếng có cả mẫu lẫn chất đối chứng

10.6.3  Chất kiểm soát ức chế là plasmid hoặc oligonucleotit

Chất kiểm soát ức chế là plasmid hoặc oligonucleotit sở hữu các trình tự bổ sung cho các đoạn mồi được sử dụng để khuếch đại Legionella spp. hoặc L. pneumophila đích. Do đó, nó được đồng khuếch đại với đích. Bảng 12 đưa ra cách giải thích định tính các kết quả kiểm soát ức chế.

Cần phân tích ADN pha loãng nếu quá trình tinh sạch ADN không đúng phụ thuộc vào chất ức chế.

Bảng 12 - Diễn giải kiểm soát ức chế khi kiểm soát đó là plasmid hoặc oligonucleotit

Khuếch đại nhiều kiểu gen

Giải thích

Trình tự Legionella spp. hoặc L. pneumophila đặc hiệu

Kiểm soát ức chế

...

...

...

Phù hợp

Có mặt ADN Legionella spp. hoặc L. pneumophila

+

Không phù hợp

Có mặt ADN Legionella spp. hoặc L pneumophila

Ức chế từng phần hoặc cạnh tranh, cùng một ADN dịch chiết mẫu phải được pha loãng cho đến khi thu được kiểm soát ức chế dương tính

-

Phù hợp

Không có ADN Legionella spp. hoặc L. pneumophila ở giới hạn phát hiện của phương pháp

...

...

...

Không phù hợp

Ức chế, ADN dịch chiết mẫu phải được pha loãng cho đến khi thu được đối chứng nội dương tính

a Kiểm soát ức chế (IC) không tuân thủ nếu giá trị Ct hoặc độ dốc của nó khác đáng kể so với giá trị được quan sát được trên kiểm soát ức chế mẫu được khuếch đại trong điểm gần nhất của dải hiệu chuẩn. Sự trôi Ct được coi là đáng kể nếu giá trị Ct của IC không nằm trong khoảng μ_ct ± 3s_Ct (trong đó μ_Ct và s_Ct, tương ứng, là giá trị trung bình và độ lệch chuẩn của các giá trị Ct của các kiểm soát ức chế bên trong của các dung dịch dải hiệu chuẩn khác nhau).

Đối với phương pháp đã được bên thứ ba đánh giá xác nhận, phải tuân các hướng dẫn của nhà sản xuất.

11  Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm ít nhất các thông tin sau:

a) Phương pháp thử được sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

b) Tất cả các thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

c) Ngày và điều kiện lấy mẫu;

...

...

...

e) Thể tích đã lọc của mẫu;

f) Các kết quả được nêu trong Điều 8;

g) Xử lý sau 24 h lấy mẫu hoặc mọi chi tiết không nêu trong tiêu chuẩn này mà có thể ảnh hưởng đến kết quả.

Phụ lục A

(Tham khảo)

Ví dụ về quy trình sản xuất dung dịch ADN chuẩn định lượng

Dịch cấy được chuẩn bị trong môi trường lỏng (BCYE) ở 37 °C ± 2 °C từ khuẩn lạc L. pneumophila (WDCM 00107) được phân lập trên môi trường chọn lọc.

Mật độ quang học được đo ở bước sóng 600 nm. Pha tăng trưởng theo cấp số nhân thu được đối với giá trị mật độ quang 0,5 ± 0,1.

...

...

...

Số lượng và chất lượng ADN L. pneumophila được đo sau khi tinh sạch ADN và xử lý với Rnase (để phân hủy RNA còn dư). Các giá trị này thu được bằng cách đọc mật độ quang ở bước sóng 260 nm và 280 nm.

Tỷ số giữa mật độ quang thu được ở bước sóng 260 nm với mật độ quang thu được ở bước sóng 280 nm phải nằm trong khoảng từ 1,7 đến 2,0 để cho thấy chất lượng của ADN tách chiết được đạt yêu cầu. Tỷ lệ mật độ quang nhỏ hơn 1,7 cho thấy độ tinh khiết của ADN được tách chiết không đạt yêu cầu và trên 2,0 cho thấy số lượng ADN được đánh giá quá cao do các vết của RNA: hoạt động RNase không hoàn toàn.

Ngoài ra, có thể kiểm tra chất lượng và số lượng ADN bằng cách điện di trong gel với dấu hiệu bán định lượng.

Nồng độ dung dịch ADN (đã tinh sạch), tính bằng microgam trên lít, được tính theo Công thức (A.1)

Trong đó:

[ADN] là nồng độ dung dịch ADN (đã tinh sạch) được biểu thị bằng miligam trên mililít;

A(260) là mật độ quang đo được ở bước sóng 260 nm.

Dịch chiết ADN được pha loãng để thu được điểm cao nhất trong khoảng (ví dụ: 160 000 GU/5 pl, tức là nồng độ ADN là 688 000 fg/5 μL.

...

...

...

Dung dịch ADN được bảo quản ở -20 °C.

Phụ lục B

(Tham khảo)

Ví dụ về phương pháp xác định giới hạn ngưỡng của chu trình

Việc theo dõi PCR real-time được thực hiện bằng cách đọc tín hiệu phát xạ huỳnh quang ở mỗi chu trình. Tín hiệu này tỷ lệ thuận với số lượng đơn vị gen có trong giếng phản ứng. Nhiễu nền bị vượt quá sau một số chu trình (tương ứng với C_t) phụ thuộc vào số lượng đơn vị gen ban đầu.

Việc định lượng các mẫu chưa biết có được bằng cách sử dụng Ct của mẫu và hàm hiệu chuẩn

Trong ví dụ sau, các điểm dải xác định là 30 GU, 300 GU, 3 000 GU và 30 000 GU trong các giếng PCR

Ví dụ, khi kết thúc PCR, có thể thu được các cấu hình bên dưới (xem Hình B.1).

...

...

...

CHÚ DẪN:

X  Chu trình

Y  PCR đường cơ sở đã trừ RFU

CHÚ THÍCH: Trong ví dụ này, độ dốc là -3,26 và điểm chặn là 39,1.

Hình B.1- Sơ đồ thu được

Dữ liệu được xử lý lại sử dụng dải hiệu chuẩn. Để thực hiện việc này, xác định dải chu trình trong đó phép đo huỳnh quang không vượt quá nhiễu nền (trong ví dụ này là 22 chu trình đầu tiên) và vị trí của ngưỡng trên thang huỳnh quang (trong ví dụ này là giá trị 6) tại đáy của chu trình và trên nhiễu nền.

C_t tương ứng với giá trị của trục hoành của giao điểm của đường huỳnh quang và ngưỡng. Điều này tương ứng với số lượng chu trình.

Hàm số

...

...

...

y = ax’ + b                 (B.1)

Trong đó:

y là giá trị C_t;

a là độ dốc của đường chuẩn từ đó tính được e là hiệu quả PCR;

b là điểm chặn (C_t theo lý thuyết tương ứng với một đơn vị gen, C_t,1GU);

x’ là log10niGU trong đó niGU (nicu = 10 [x’]) là số đơn vị gen ban đầu:

x’ = (y - b)/a                 (B.2)

Phụ lục C

...

...

...

Ví dụ về nghiên cứu hàm hiệu chuẩn pha PCR định lượng

C.1  Bảng dữ liệu và tính toán

Các phép tính được nêu trong ví dụ này đã được làm tròn để tạo điều kiện thuận lợi cho việc thể hiện dữ liệu. Trong thực tế, các phép tính phải được thực hiện mà không làm tròn các giá trị.

Xem Bảng C.1.

Bảng C.1 - Dữ liệu và tính toán

Mức x_i

30

300

3 000

...

...

...

Tổng

1,48

2,48

3,48

4,48

y_i,j, k = 5 lần lặp lại

35,18

...

...

...

27,27

23,97

34,84

31,41

27,58

24,12

34,80

...

...

...

27,36

24,06

34,48

37,27

27,52

24,27

34,80

...

...

...

27,55

24,77

...

...

...

774,10

756,26

137,28

120,47

T_G = 588,11

34,82

31,25

27,46

...

...

...

257,17

387,52

477,34

539,36

Trong đó:

x_i là số đơn vị gen của Legronella spp.hoặc L.neumophila trên mỗi ống phản ứng;

...

...

...

y_i,j là phép đo giá trị C_t ở mức I (i= 1 ... p) và hàng j (j= 1 ... k);

k là số lần lặp lại trên mỗi mức i, k = 5;

p là số mức, P = 4.

N = kp = 5 x 4 = 20 theo Công thức (1).

C.2  Ước lượng đường hồi quy

C.2.1  Tính toán các yếu tố cần thiết

theo Công thức (3)

...

...

...

C.2.2  Tính toán độ dốc a

Phương sai x’_i được tính theo:

theo Công thức (5). Phương sai của x’y được tính theo

theo Công thức (6). Do đó, độ dốc là

theo Công thức (7) “a” nằm trong khoảng từ -4,155 đến -2,839 và hệ thống khuếch đại được xác nhận.

C.2.3  Tính điểm chặn b

...

...

...

và trục tung là

vì

và do đó

Công thức hồi quy được tính theo Công thức (2):

...

...

...

Hiệu suất e được tính theo Công thức (8):

trong đó e nằm trong khoảng từ 75 % đến 125 % và hiệu quả được xác nhận.

C.4  Ước tính hiệu suất tuyến tính

Hiệu suất của độ tuyến tính được ước tính sử dụng các phép tính nêu trong Bảng 6. Các giá trị thu được được thể hiện trong Bảng C.2.

Bảng C.2 - Độ chệch, độ chụm, độ chính xác và độ không đảm bảo của các phép tính tuyến tính

Mức x_i ước tính

30

300

...

...

...

30000

x’_i lý thuyết

1,4771

2,4771

3,4771

4,4771

x’_i,j

1,3967

2,5236

...

...

...

4,4704

1,4899

2,4304

3,4805

4,4292

1,5009

2,5017

3,5409

4,4457

...

...

...

2,4852

3,4970

4,4046

1,5009

2,4276

3,4888

4,4320

7,4770

...

...

...

17,5727

22,1818

1,4954

2,4737

3,5145

4,4363

0,0183

...

...

...

0,0374

-0,0407

0,0680

0,0430

0,0368

0,02411

0,0704

...

...

...

0,0525

0,0473

0,2241

0,1373

0,1670

0,1505

31

...

...

...

3270

27372

Vì E_lini ≤ 0,15 đối với tất cả các mức, nên độ tuyến tính được xác nhận cho toàn bộ dải.

Phụ lục D

(Tham khảo)

Phân bố Student điển hình

Bảng D.1 cho thấy phân bố Student đối với mức rủi ro α = 5 % hoặc phép thử hai phía (1 - α/2)

Bảng D.1 - Phân bố student điển hình

...

...

...

0,05

1 - α/2

0,975

1

12,706

2

4,303

3

3,182

...

...

...

2,776

5

2,571

6

2,447

7

2,365

8

2,306

...

...

...

2,262

10

2,228

11

2,210

12

2,179

13

2,160

...

...

...

2,145

15

2,131

16

2,120

17

2,110

18

2,010

...

...

...

2,093

20

2,086

25

2,060

30

2,042

40

2,021

...

...

...

2,009

60

2,000

100

1,984

1,960

Phụ lục E

...

...

...

Ví dụ về đánh giá độ thu hồi

Lấy 5 khuẩn lạc từ dịch nuôi cấy Legionella 72H và cấy vào ống đựng 9 ml muối trypton.

Lấy 250 μL mẫu huyền phù gốc và trộn với 1,25 mL dung dịch đệm phân giải (thể tích cuối cùng: 1,5 mL). Sau đó, dịch phân giải được pha loãng đến 10^-2 và lấy 5 μL của dung dịch pha loãng này để phân tích PCR. Lặp lại ba lần để thu được ba dịch phân giải.

Các phép đo PCR được thực hiện trên ba dịch phân giải trực tiếp cho kết quả trung bình là 8300 GU/5 μL. Nồng độ tính theo log₁₀GU/mL của huyền phù gốc là

Để tạo các dung dịch thêm chuẩn, nuôi cấy 250 μl các dãy pha loãng d₃ (10^-3) hoặc d⁵ (10_-5) của huyền phù gốc. Ví dụ, định lượng PCR 1580 GU được cấy sẽ thu được mức 100 000 GU.

Theo Công thức (17).

Xem Bảng E.1.

...

...

...

Mức

Độ thu hồi mẫu

Độ thu hồi trung bình

Độ lệch chuẩn

100 000 GU

-0,24

-0,09

0,17

-0,02

...

...

...

-0,18

0,09

-0,10

-0,29

0,20

-0,25

0,07

1 000 GU

-0,09

...

...

...

0,16

0,18

0,33

0,08

0,37

-0,12

0,14

0,26

-0,19

...

...

...

Phụ lục F

(Tham khảo)

Ví dụ về đánh giá độ không đảm bảo tổng thể

Bảng F.1- Ví dụ về đánh giá độ không đảm bảo tổng thể

Mức

Độ thu hồi mẫu

Độ thu hồi trung bình

Phương sai

...

...

...

Nước vệ sinh nóng

Nước từ tháp làm mát

100 000 GU

-0,24

-0,37

-0,30

-0,218

0,105

-0,02

...

...

...

0,14

-0,22

-0,77

-0,61

-0,18

-0,45

-0,81

0,09

-0,13

...

...

...

-0,10

-0,59

-0,38

-0,29

0,74

-0,40

0,20

-0,66

-0,38

...

...

...

-0,58

-0,20

0,07

-0,67

-0,27

1 000 GU

-0,09

-0,41

0,18

...

...

...

-0,42

0,55

0,33

-0,40

-0,61

0,08

-0,48

-0,64

0,37

...

...

...

0,27

-0,12

-0,56

-0,46

0,14

-0,09

0,21

0,26

-0,20

...

...

...

-0,19

-0,18

-0,47

0,26

-0,07

-0,24

Phụ lục G

...

...

...

Đánh giá hiệu năng của phương pháp đã được bên thứ ba đánh giá xác nhận

G.1  Nguyên tắc

Quy trình đánh giá xác nhận phương pháp được mô tả trong phần dưới đây tương ứng với đánh giá xác nhận thứ cấp của phương pháp, có thể áp dụng cho mọi ứng dụng của phương pháp đã được bên thứ ba xác nhận trong phòng thí nghiệm.

Quy trình này có thể thay thế cho các yêu cầu nêu trong Điều 9 nếu:

- Phương pháp đã được bên thứ ba chứng nhận thỏa đáng hoặc đánh giá xác nhận trước (đánh giá xác nhận ban đầu, theo các yêu cầu nêu trong Điều 9);

- Phương pháp đã đánh giá được áp dụng toàn bộ trong phòng thí nghiệm (cùng một loại vật liệu, không thay đổi quy trình);

- Trong trường hợp sử dụng phương pháp để phát hiện định tính, nhà cung cấp (nhà sản xuất) phương pháp đã được bên thứ ba đánh giá xác nhận có thể cung cấp ngưỡng tín hiệu (b trong phương trình tuyến tính y = ax + b nêu trong 7.4) về sự có mặt/không có mặt.

G.2  Tiêu chí đánh giá xác nhận

Các tiêu chí đánh giá xác nhận bao gồm:

...

...

...

- Đánh giá đường chuẩn: ít nhất năm dải trong các điều kiện tái lập trung gian;

- Kiểm tra xác nhận LQ_qPCR: để xác nhận LQ_qPCR điểm đầu tiên của năm dải hiệu chuẩn được phân tích trong các điều kiện tái lập trung gian;

- Kiểm tra xác nhận LQ_qPCR: để để xác nhận trên một nồng độ đích (LD), ở 10 lần lặp lại trong 2 ngày (độ tái lập trung gian);

- Độ thu hồi: (xem độ vững);

- Độ vững: để hiện thực hóa theo các yêu cầu nêu trong 9.6 đối với mẫu nước vô trùng và nền mẫu phức tạp gặp phải trong phòng thí nghiệm (ví dụ: nước từ tháp làm mát có nguồn gốc từ nước mặt). Cần phải thực hiện nghiên cứu độ thu hồi trên các nền mẫu thường gặp trong phòng thử nghiệm, trên một lượng mẫu lớn hơn hoặc bằng 8;

- Trong trường hợp phát triển bộ kít thương mại, đã được bên thứ ba đánh giá xác nhận, thì chỉ phải kiểm tra xác nhận các thông số bị ảnh hưởng do việc sửa đổi;

- Trong phụ lục này, không kiểm tra xác nhận việc nối chuẩn giữa dung dịch hiệu chuẩn và mẫu chuẩn với chuẩn gốc.

Phụ lục H

...

...

...

Nghiên cứu liên phòng thí nghiệm

Trong phụ lục này, độ chụm đã được đánh giá từ dữ liệu của 14 phép so sánh liên phòng (ILC) được thực hiện từ năm 2008 đến 2014 và được tổ chức bởi AGLAE (hiệp hội các phòng thí nghiệm của Pháp).

Các vật liệu tương tự như nước nóng làm vệ sinh đã được sử dụng. Các mẫu được chuẩn bị bằng cách sử dụng nguồn cung nước công cộng đã được trung hòa, sau đó được bổ sung các chủng vi khuẩn khác nhau. Một số chủng, đôi khi bao gồm cả chủng cấy hỗn hợp đã được sử dụng:

- Legionella pneumophila serogrup 1, Legionella pneumophila serogrup 6;

- Legionella micdadei, Legionella bozemanii, Legionella dumoffi, Legionella anisa;

- Vi sinh vật nền có thể có mặt trong các mẫu.

Số lượng phòng thí nghiệm tham gia dao động từ 33 đến 41.

Quá trình xử lý dữ liệu được thực hiện dưới sự đảm bảo chất lượng phù hợp với các yêu cầu của TCVN 6940-2 (ISO 5725-2) và đã được công nhận (xem Hình H.1 và H.2).

...

...

...

Y  C_v,R%

X  GU trên phần mẫu thử (đơn vị logt)

1  so sánh liên phòng từ năm 2008 đến 2014

2  mô hình tiến hóa

Hình H.1 - Thay đổi các giá trị của hệ số biến thiên độ tái lập (C_R,V,%) phụ thuộc vào số lượng GU trên phần mẫu thử (đơn vị log) - Legionella spp.

CHÚ DẪN

Y  C_V,R%

X  GU trên phần mẫu thử (đơn vị log)

...

...

...

2  thử nghiệm mẫu

3  mô hình tiến hóa

Hình H.2 - Thay đổi các giá trị hệ số biến thiên độ tái lập C_R,V,%) phụ thuộc vào số lượng GU trên phần mẫu thử (đơn vị log) - Legionella pneumophila

Bảng H.1- Ví dụ về độ chụm quan sát được trong phép so sánh liên phòng thí nghiệm được thực hiện vào tháng 9 năm 2013

Giá trị trung bình quan sát được bởi các phòng thí nghiệm, m^a

Khoảng tin cậy 95 % của giá trị trung bình

Độ lặp lại

Độ tái lập^b

...

...

...

1,98 x 10⁵

[1,52 x 10⁵; 2,57 x 10⁵]

2,3

7,1

a  Số lượng GU trên 200 mL.

Lưu ý rằng 200 ml tương ứng với thể tích đã lọc. Nếu 1 L được lọc, đơn vị sẽ tính bằng UG trên lít; độ lặp lại và độ tái lập sẽ không được sửa đổi.

b  Được biểu thị bằng tỷ lệ tối đa mong đợi (ở mức 95 %) giữa hai kết quả từ hai phòng thí nghiệm khác nhau. Nếu A và B là hai kết quả từ hai phòng thí nghiệm khác nhau (theo quy ước A < B); giá trị 7,1 nghĩa là có 95 % khả năng.

Độ lệch chuẩn của phân tán dữ liệu sau khi chuyển đổi log (s_log) có thể được tính từ giá trị (v), sử dụng Công thức:

Trong hình H.1, C_R,V,% so với giá trị trung bình quan sát được bởi các phòng thí nghiệm được thể hiện bằng đồ thị (số GU trên phần mẫu thử theo phép tính sau:

...

...

...

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] NCBI Genbank database. Available (viewed 2012-10-12) at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/GenbankSearch.html

[2] EMBL Nucleotide sequence database. Available (viewed 2012-10-12) at: http://www.ebi.ac.uk/embl

[3] WORLD DATA CENTER FOR MICROORGANISMS, Reference strain catalogue pertaining to organisms for performance testing culture media. Available (2012-10-12) at: http://www.wfcc.info/pdf/WDCM_Reference_Strain_Catalogue.pdf

[4] Quality Assurance/Quality Control Guidance for Laboratories Performing PCR Analyses on Environmental Samples October 2004. Available at: https://www.epa.gov/sites/production/files/2015-07/documents/epa-qaqc-pcr.pdf

[5] Wellinghausen N., Frost C., Marre R., (2001) Detection of Legionellae in hospital water samples by quantitative real-time LightCycler PCR. Appl Environ Microbiol 67, pp. 3985-3993

[6] Wullings BA, Bakker G, van der Kooij D, (2011) Concentration and diversity of uncultured Legionella spp. in two unchlorinated drinking water supplies with different concentrations of natural organic matter. Appl Environ Microbiol. 77, pp. 634-41