+ Chuẩn bị: Hòa tan các thành phần trên trong nước.

- Dung dịch 2:

+ Thành phần

Cồn 96 %

95 ml

Glycerol

05 ml

...

...

...

Bảo quản các dung dịch này trong lọ thủy tinh có nắp đậy kín, ở nhiệt độ phòng và sử dụng không quá 10 ngày.

8.1.2.2  Cách tiến hành

Gắp tuyến trùng từ dung dịch bảo quản vào chén thủy tinh (4.10) có chứa 0,5 ml dung dịch xử lý (dung dịch 1). Đặt chén này trong bình hút ẩm (4.6) đậy kín (bình hút ẩm có chứa 1/10 thể tích là cồn 96 % (5.5)). Bình hút ẩm được đặt trong tủ ấm (4.7) ở điều kiện nhiệt độ cố định 40 °C với thời gian tối thiểu là 12 giờ.

Lấy chén thủy tinh ra khỏi bình hút ẩm, thêm dung dịch xử lý (dung dịch 2). Đậy nắp một phần miệng chén để cồn bay hơi từ từ. Chén thủy tinh có chứa tuyến trùng tiếp tục giữ trong tủ ấm ở điều kiện nhiệt độ cố định 40 °C. Sau 2 giờ đến 3 giờ bổ sung thêm dung dịch 2 vào chén thủy tinh cho gần đầy, lặp lại bước này 2 lần đến 3 lần. Tới khi chén thủy tinh chỉ còn lại glycerol có chứa tuyến trùng và có thể sử dụng làm tiêu bản cố định được.

Hoặc đặt chén thủy tinh chứa tuyến trùng trong glycerol nguyên chất trong bình hút ẩm có chứa vôi cục (5.10). Bảo quản lâu dài để làm tiêu bản cố định.

8.1.3  Làm tiêu bản

Lấy lam kính (4,12) sạch và làm vòng paraphin hoặc sáp ong (5.7) (đường kính khoảng 1 cm) trên lam kính. Cho 1 giọt glycerol nguyên chất vào giữa vòng paraphin hoặc sáp ong. Dùng kim (4.11) gắp, gắp 5 cá thể tuyến trùng (đã xử lý trong dung dịch bảo quản) đặt vào giữa giọt glycerol, chỉnh cho các cá thể tuyến trùng nằm cùng một hướng. Đậy lamen (4.13) và đặt lam kính trên bàn nhiệt cho paraphin hoặc sáp ong tan chảy. Nhấc nhanh lam kính và đặt ra chỗ mát. Gắn keo (5.9) bảo vệ.

8.2  Các đặc điểm hình thái giám định

8.2.1  Đặc điểm nhận dạng giống Ditylenchus

...

...

...

Không có kim hút ………………………………………………………….. không phải Ditylenchus

2. Phần trước của thực quản thường có dạng hình trụ. Thực quản (diều) gồm 3 phần: diều trước, diều giữa và diều sau (diều tuyến) …………………………………………………………. 3

Thực quản hình trụ hoặc 2 phần: diều trước hẹp, phần sau phình to ………………. không phải Ditylenchus

3. Con cái hình giun dài ………………………………………………………………………………4

Con cái phình to dạng túi hoặc bầu dục ………………………………… không phải Ditylenchus

4. Diều tuyến dạng củ hành hoặc dạng thùy, không kéo dài hoặc hơi phủ. Khung đầu yếu, kim hút mảnh, gốc kim hút nhỏ, đuôi hình nón, thon, nhọn ……………………………………….5

Diều tuyến dạng thùy, kéo dài chờm lên ruột, khung đầu rõ, kitin hóa mạnh, kim hút to, rõ, đuôi có các hình dạng khác ……………………………………….. nhau không phải Ditylenchus

5. Có một buồng trứng, nằm về phía trước. Lỗ sinh dục ở nửa sau cơ thể……………………..6

Buồng trứng đôi. Lỗ sinh dục khoảng giữa cơ thể hoặc hơi lùi về phía sau……….. không phải Ditylenchus

...

...

...

Con cái sưng phồng, Collumella có hơn 20 tế bào…………………….. không phải Ditylenchus

7. Kim hút mảnh, gốc kim hút nhỏ, dài khoảng 7 đến 11 µm và luôn nhỏ hơn 20 µm ………….. Ditylenchus

Không bao gồm các đặc điểm trên ………………………………………. không phải Ditylenchus

8.2.2  Đặc điểm nhận dạng tuyến trùng Ditylenchus angustus (Butler) Filipjev là đối tượng kiểm dịch thực vật nhóm I của Việt Nam.

Đặc điểm hình thái chính để định loại đến loài:

Đặc điểm hình thái chung:

Tuyến trùng hình giun dài, mảnh, Vùng môi thấp. Khung đầu kitin hóa yếu. Kim hút mảnh, gốc kim hút nhỏ. Diều giữa phát triển yểu, cơ hóa và sau đó là sự dầy lên của vách ống thực quản. Đuôi hình nón, thon, nhọn. Con cái không phình to, có một buồng trứng. Lỗ sinh dục nằm ở nửa sau cơ thể. Collumella xếp thành 4 hàng, mỗi hàng có 4 tế bào. Có túi sau dạ con.

Đặc điểm hình thái tuyến trùng Ditylenchus angustus (Butler) Filipjev (Chi tiết như hình 1)

- Kích thước của tuyến trùng Ditylenchus angustus (Butler) Filipjev

...

...

...

+ Con đực: L = 0,7 - 1,18 mm; a = 40 - 55; b = 6 - 8; c = 19 - 26; T = 60 - 73 %; gai giao cấu = 16-21 µm; gai đệm = 6-9 µm; kim hút = 10 µm.

+ Tuyến trùng non: L = 0,5 - 0,7 mm; a = 41 - 60; b = 6 - 9; c= 14 -18; kim hút = 8 -10 µm.

Trong đó:

n: Tổng số cá thể quan sát, đo đếm.

L: Tổng chiều dài cơ thể

a: Chiều dài cơ thể/chiều rộng lớn nhất (thường là vị trí lỗ sinh dục)

b: Chiều dài cơ thể/chiều dài từ đỉnh đầu cơ thể đến van ruột-thực quản

c: Chiều dài cơ thể/chiều dài đuôi

V: Chiều dài cơ thể từ đỉnh đến lỗ sinh dục x 100/chiều dài cơ thể

...

...

...

O: khoảng cách từ gốc kim hút đến lỗ mở tuyến thực quản lưng

Con cái: Cơ thể dài, mảnh, gần như thẳng hoặc hơi cong về phía bụng khi xử lý bằng nhiệt. Lớp biểu bì có vòng ngang mịn, rộng khoảng 1 µm ở khoảng giữa cơ thể. Môi thấp, bằng. Khung đầu kitin hóa yếu, chia 6 thùy. Khi nhìn thẳng có 6 môi gần bằng nhau. Có 4 đường bên, chiếm 1/4 độ rộng cơ thể hoặc nhỏ hơn. Các đường bên phía ngoài rõ hơn đường bên ở trong và kéo dài đến gần tận cùng đuôi. Deirids nằm ngay sau lỗ bài tiết. Phasmids nằm sát sau khoảng giữa đuôi, dạng chấm, rất khó quan sát. Kim hút nhỏ, phần nón yếu, dài khoảng 45 % chiều dài kim hút. Gốc chân kim hút nhỏ, rõ, mặt trước vát về phía sau, hiếm khi hợp nhất với nhau, rộng khoảng 2 µm. Diều trước hình trụ, hẹp và nối liền diều giữa, dài khoảng 3 đến 3,6 lần chiều rộng cơ thể. Diều giữa hình ovan, van diều giữa rõ, nằm khoảng phía trước đến chính giữa. Eo thắt hẹp, hình trụ, dài 1,5 lần đến 1,9 lần chiều dài diều trước. Diều sau hình ca-la-vát; dài 27 µm đến 34 µm, chờm nhẹ lên ruột, chủ yếu về bên bụng, có 3 hạt nhân riêng biệt. Không có cardia. Vòng thần kinh rõ rệt, nằm khoảng 21 µm đến 35 µm sau diều giữa. Lỗ bài tiết nằm khoảng 90 µm đến 110 µm từ đầu, hơi về phía trước phần bắt đầu diều sau. Hemizonid 3 µm đến 6 µm trước lỗ bài tiết. Lỗ sinh dục dạng khe ngang, ống âm đạo xiên, chiếm hơn 1/2 chiều ngang cơ thể. Túi chứa tinh, chứa tinh trùng to, tròn. Buồng trứng kéo dài phía trước. Trứng xếp thành 1 hàng đơn, hiếm khi thành hàng đôi. Túi sau dạ con dài khoảng 2 lần đến 2,5 lần chiều rộng cơ thể tại lỗ sinh dục, không có tinh trùng, kéo dài khoảng 1/2 đến 2/3 khoảng cách từ lỗ sinh dục đến lỗ hậu môn. Đuôi hình nón, dài 5,2 lần đến 5,4 lần chiều rộng cơ thể. Thon nhọn dần đến tận cùng đuôi giống như một mấu (gai).

Con đực: Hình thái tương tự như con cái. Có vây đuôi, hẹp ở một số mẫu, bắt đầu từ vị trí đối diện gần cuối gai giao cấu kéo dài đến gần tận cùng đuôi. Gai giao cấu đơn giản, cong về phía bụng. Gai đệm ngắn, đơn giản.

Tuyến trùng non: Đặc điểm chung về hình thái tương tự như con trưởng thành, nhưng khác về kích thước tuyến thực quản: dài hơn con trưởng thành.

Hình 1 - Tuyến trùng Ditylenchus angustus (Butler) Filipjev

A: Con cái, B: Phần đầu con đực, C: Đầu nhìn từ đỉnh, D: Khung đầu, E: Phần cắt ngang cơ thể con cái, F: Đuôi con cái, G: Đường bên, H: Đuôi tuyến trùng non, I.J: Đuôi con đực, K: Lỗ sinh dục con cái.
(NGUỒN: D.R. Seshadri, D.R. Dasgupta, 1975)

9  Báo cáo kết quả

Mẫu giám định được kết luận là loài tuyến trùng Ditylenchus angustus (Butler) Filipjev khi các đặc điểm hình thái của mẫu giám định phù hợp với các đặc điểm đã nêu ở mục 8.2.

...

...

...

- Thông tin về mẫu giám định.

- Tên loài

- Phương pháp giám định

Phiếu kết quả giám định chi tiết có thể tham khảo phụ B.

Phụ lục A

(Tham khảo)

Thông tin chung

A.1  Tên khoa học và vị trí phân loại

...

...

...

- Tên tiếng Việt: Tuyến trùng tiêm đọt sần lúa

- Vị trí phân loại:

Ngành: giun tròn (Nematoda)

Bộ Rhabditida

Bộ phụ: Tylenchina

Họ Anguinidae

Giống Ditylenchus

Loài D. angustus

A.2  Phân bố

...

...

...

Châu Á: Băng-la-đét, Ấn Độ, In-đô-nê-xi-a, Pa-ki-xtan, Phi-líp-pin, Thái Lan;

Châu Phi: Ai Cập, Ma-đa-ga-xca, Xu-đăng

A.3  Ký chủ

Phạm vi ký chủ của loài này là các loài Oryza spp., lúa và một số loài lúa dại. Bao gồm cây trồng thuộc họ Poaceae: Echinochloa colona (cỏ lồng vực cạn), Leersia hexandra (cỏ lúa), Oryza (chi lúa), Oryza sativa (lúa), Sacciolepsis interrupta (cỏ bấc).

Phụ lục B

(Tham khảo)

Mẫu phiếu kết quả giám định

Cơ quan Bảo vệ
và kiểm dịch thực vật

...

...

...

………………………………….

…………., ngày……tháng…..năm 20….

PHIẾU KẾT QUẢ GIÁM ĐỊNH

1. Tên hàng hóa:

2. Nước xuất khẩu:

3. Xuất xứ:

4. Phương tiện vận chuyển:                                        Khối lượng:

5. Địa điểm lấy mẫu:

6. Ngày lấy mẫu:

...

...

...

8. Tình trạng mẫu:

9. Ký hiệu mẫu:

10. Số mẫu lưu:

11. Người giám định:

12. Phương pháp giám định: Theo TCVN12194-2-3:2018, Quy trình giám định tuyến trùng gây bệnh thực vật. Phần 2-3: Yêu cầu cụ thể đối với với tuyến Ditylenchus angustus (Butler) Filipjev

13. Kết quả giám định:

Tên khoa học: với tuyến trùng Ditylenchus angustus (Butler) Filipjev

Bộ: Rhabditida

Bộ phụ: Tylenchina

...

...

...

Giống: Ditylenchus

Loài: Ditylenchus angustus

Là đối tượng kiểm dịch thực vật thuộc danh mục đối tượng kiểm dịch thực vật của Việt Nam.

TRƯỞNG PHÒNG KỸ THUẬT
(hoặc người giám định)
(ký, ghi rõ họ và tên)

THỦ TRƯỞNG ĐƠN VỊ
(ký, ghi rõ họ và tên, đóng dấu)

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Bridge J, Luc M, Plowright RA, (1990). Nematode parasites of rice. In: Luc M, Sikora RA, Bridge J, eds. Plant Parasitic Nematodes in Subtropical and Tropical Agriculture. Wallingford, UK: CAB International, 69-108.

...

...

...

[3] Cuc NTT, (1982). Field soil as a source of rice stem nematodes. International Rice Research Newsletter, 7:15.

[4] Cuc NTT, Giang LT, (1982). Relative humidity and nematode number and survival in rice seeds. International Rice Research Newsletter, 7:14.

[5] Cuc NTT, Kinh DN, (1981). Rice stem nematode diseases in Vietnam. International Rice Research Newsletter, 6:14-15.

[6] Cuc NTT, Prot JC, (1992). Root-parasitic nematodes of deep-water rice in the Mekong Delta of Vietnam. Fundamental and Applied Nematology, 15(6):575-577; 14 ref.

[7] Dang-ngoc Kinh, (1981). Survival of Ditylenchus angustus in diseased stubble. International Rice Research Newsletter, 6(6):13.

[8] Dang-ngoc Kinh, Chau-Dieu Phuong, (1981). Reaction of some deepwater rice varieties to Ditylenchus angustus. International Rice Research Newsletter, 6(6):6-7.

[9] Dang-ngoc Kinh, Nguyen-thi Nghiem, (1982). Reaction of rice varieties to stem nematodes in Vietnam. International Rice Research Newsletter, 7(3):6-7.

[10] IPPC, (2006), ISPM 27 Diagnostic protocols for regulated pests

[11] Sturhan D. and Brzeski M.W. (1991). Stem and bulb nematodes, Ditylenchus spp. In: Manual of agricultural nematology (Ed. William R. Nickle). Marcel Dekker, INC. New York, USA, 423 - 464.

...

...

...

[13] Trịnh Thị Thu Thủy, Nguyễn Thị Yến, Dương Minh Tú, 2014. Xác định phân bố của hai loài tuyến trùng Ditylenchus angustus (Butler) Filipjev và Aphelenchoides nechaleos n.sp. trên lúa tại Việt Nam, Tạp chí Bảo vệ thực vật, số 4, trang 3-6.