KẾT QUẢ THEO DÕI SINH VẬT GÂY HẠI TRÊN GIỐNG CÂY
NHẬP KHẨU TRONG KHU CÁCH LY KIỂM DỊCH THỰC VẬT

Tên của Tổ chức/ cá nhân nhập khẩu:

(Địa chỉ, số điện thoại, fax)

Thông báo số:

Nhập khẩu từ:

Cửa khẩu đến (đơn vị gửi mẫu):

Khối lượng mẫu gửi:

Số lượng mẫu gửi:

...

...

...

Tên giống cây

Địa điểm gieo trồng

Phương pháp điều tra theo dõi

Số lượng mẫu gieo trồng

Số lượng mẫu điều tra

Số lượng mẫu bị nhiễm

Quan sát

Tên dịch hại, mật độ

Tên dịch hại thuộc diện điều chỉnh, mật độ

...

...

...

GIÁM ĐỐC

TRUNG TÂM KDTV SAU NHẬP KHẨU

(Ký tên, đóng dấu)

PHỤ LỤC 2.

MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG ĐỂ GIÁM ĐỊNH BỆNH TRÊN GIỐNG CÂY CÓ MÚI NHẬP KHẨU

1. Phương pháp ELISA

Là phương pháp thử nghiệm miễn dịch liên kết men để giám định tác nhân gây bệnh dựa vào phản ứng đặc hiệu kháng nguyên-kháng thể. Phương pháp ELISA gồm có DAS –ELISA và Indirect –ELISA. Cả hai phương pháp này đều được thực hiện trên nguyên tắc chung của phương pháp ELISA đó là dựa vào phản ứng đặc hiệu kháng nguyên-kháng thể có nghĩa là kháng nguyên nào thì liên kết với kháng thể ấy và quy trình bao gồm 4 bước như sau:

...

...

...

+ Bước 2: Cố định kháng thể đặc hiệu kháng nguyên (đối với Indirect - ELISA) hoặc kháng nguyên đặc hiệu kháng thể (DAS - ELISA) vào bản ELISA.

+ Bước 3: Gắn kháng thể đặc hiệu kháng thể (đối với Indirect - ELISA) hoặc kháng thể đặc hiệu kháng nguyên (Đối với DAS - ELISA) có liên kết Enzim

+ Bước 4: Cố định chất nền và đánh giá kết quả.

Bộ Kit thông dụng để kiểm tra có thể sử dụng cho các bệnh sau:

- Xylella fastidiosa

- Spiroplasma citri (Xoắn khuẩn)

- Satsuma dwarf ilarvirus (Lùn Satsuma)

- Citrus tristeza closterovirus (Tàn lụi cam quýt)

- Citrus tatter leaf cappillovirus (Virus nhỏ lá cam quýt)

...

...

...

2. Phương pháp PCR

Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) được Kary Mullis và cộng sự (Mỹ) phát minh năm 1985 và kể từ đó đã tạo nên một tác động to lớn đối với các nghiên cứu sinh học trên toàn thế giới. Ðây là phương pháp in vitro sử dụng các cặp mồi để tổng hợp số lượng lớn các bản sao từ một trình tự ADN đặc biệt dựa trên hoạt động của enzyme polymerase. Phương pháp PCR dựa trên hoạt động của ADN polymerase trong quá trình tổng hợp ADN mới từ mạch khuôn. Tất cả các ADN polymerase đều cần những mồi, là những đoạn ADN ngắn có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn. Ðoạn mồi này sau đó sẽ được nối dài ra nhờ hoạt động của AND polymerase để hình thành một mạch mới hoàn chỉnh.

Một phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba giai đoạn:

- Giai đoạn biến tính: tách chuỗi ADN từ mạch đôi thành dạng mạch đơn

- Giai đoạn bắt cặp: gắn cặp mồi đặc trưng theo nguyên tắc bổ sung

- Giai đoạn kéo dài chuỗi: tổng hợp chuỗi AND mới giống chuỗi AND gốc

Sau đó sản phẩm PCR đem chạy điện di để xác định tác nhân gây bệnh dựa vào trọng lượng phân tử AND so với đối chứng

Nhờ phương pháp này, chúng ta có thể xác định đư ợc tác nhân gây bệnh ngay cả khi nồng độ của chúng rất thấp.

3. Phương pháp cây chỉ thị

...

...

...

Cây chỉ thị

Tác nhân gây bệnh

Citrus sinensis

Psorosis complex (Tổ hợp Virus bệnh đốm)

Spiroplasma citri

Liberobacter asiaticum

...

...

...

Citrus limon

Citrus tristeza closterovirus, yellows strain (Virus tàn lụi cam quýt)

Citrus leaf rugose virus (Virus quăn lá cam quýt)

Citrus variegation ilarvirus

Citrus medica

Citrus exocortis viroid (Viroid vẩy vỏ)

Citrus aurantifolia

...

...

...

Citrus vein enation virus (Virus biến dạng gân lá)

P. trifoliata X C. sinensis

Citrus tatter leaf capillovirus (Nhỏ lá cam quýt)

3.2. Các ngưỡng nhiệt độ cần chú ý khi giám định bệnh bằng cây chỉ thị

Dùng cây chỉ thị để xác định những bệnh ẩn của cây có múi ở hai mức nhiệt độ:

* Nhiệt độ 18 - 25^oC (tốt nhất là 20 - 22 ^oC) cho các tác nhân gây bệnh sau:

- Viruses Citrus tristeza closterovirus (Virus tàn lụi cây có múi)

- Citrus veinenation virus (Virus biến dạng gân lá cây có múi)

...

...

...

- Citrus leaf rugose virus (Vius quăn lá cây có múi)

- Citrus tatter leaf cappillovirus (Virus bé lá cây có múi)

* Nhiệt độ 25 - 35^oC (tốt nhất là 30 - 35 ^oC) cho tác nhân gây bệnh:

- Citrus exocortis viroid (Viroid vảy vỏ cây có múi)

- Citrus cachexia viroid (Viroid mạch dẫn cây có múi)

- Spiroplasma citri (xoắn khuẩn cam quýt)

- Liberobacter asiaticum

- Liberobacter africanum

3.3. Một số triệu chứng bệnh trên cây chỉ thị

...

...

...

Bệnh

Sweet Orange

(Cam ngọt)

Eureka Lemon (Chanh Eureka)

West Indian Lime (Chanh Tây Ấn)

Citrange cv Rusk or Swingle (Chanh, bưởi, quýt)

Etrog Citron (Chanh yên)

Citrus leaf rugose

...

...

...

CF

LP

Citrus variegation

(Biến dạng gân lá)

...

...

...

Crinkly leaf

(Giòn lá)

AS

...

...

...

LP

Cristacortis

OL

...

...

...

OL

Lạnh

Psorosis A

(Đốm lá dòng A)

CF

...

...

...

Psorosis B

(Đốm lá dòng B)

OL

...

...

...

Tatter Leaf / Stunt

(Nhỏ lá/lùn)

CM &S

...

...

...

Tristeza - Stempitting

(Đốm tàn lụi)

CVF&WP

Tristeza - Yellows

...

...

...

LY & S

Vein Enation / Woody Gall (Biến dạng/u thân gỗ)

...

...

...

Exocortis

LE

...

...

...

Greening and Dieback (Greening và khô cành)

VY & LM

Stubborn

CM

...

...

...

AS - Asteroid Spots (Đốm dạng sao)

CF - Chlorotic flecks (Đốm vàng)

CM-Chlorotic Mottling (Đốm mất màu)

LE - Leaf Epinasty        

 LM - Leaf Mottle (Đốm lá)

...

...

...

 LY - Leaf Yellowing (Vàng lá)

OL - Oak Leaf Pattern (Dải sùi lá)

 S - Stunting (Lùn cây)

VE - Vein Enation (Biến dạng gân)

 VY - Vein Yellowing (Vàng gân)

WP - Wood Pitting (Đốm thân gỗ)

CVF - Chlorotic Vein Flecking (biến vàng gân)

...

...

...

PHƯƠNG PHÁP NHÂN GIỐNG, CHĂM SÓC VÀ BẢO QUẢN TẠI CƠ SỞ SAU NHẬP KHẨU

1. Nhân giống, chăm sóc và bảo quản tại cơ sở sau nhập khẩu

1.1. Nhân gốc ghép và cây chỉ thị

Các hạt được gieo để làm cây chỉ thị sinh học hoặc gốc ghép được lấy từ các cơ sở sạch bệnh có uy tín, các hạt này đem gieo trong khay và để ở nhiệt độ 20 - 25 ^oC. Cây chỉ thị là chanh yên (Etrog) được nhân giống từ cành ở nhiệt độ 30 - 35^oC. Trước khi sử dụng làm cây chỉ thị hoặc gốc ghép không bón thúc cho cây. Sau đó chuyển chúng vào chậu hoặc túi nilon có dung tích 2,5 l trong có chứa giá thể. Nếu cây biểu hiện triệu chứng thiếu dinh dưỡng thì sẽ bón bổ sung bằng hỗn hợp chất độn với tỷ lệ 1 máu khô và bột xương: 1Dolomit. Sau đó chanh Yên (Etrog) và một số loại cam ngọt được trồng trong điều kiện nhiệt độ 30 - 35 ^oC.

1.2. Nhân giống từ mắt ghép

Hai cây được nhân giống từ mắt ghép trên gốc chanh sần. Ba đến bốn tuần sau khi ghép mắt, cắt các chồi nách của chanh Sần để tập trung cho mắt ghép phát triển.

Chọn một cây làm cây chỉ thị. Nếu có yêu cầu thì tiến hành ghép đỉnh sinh trưởng. Cây con được nhân lên từ cây chỉ thị sẽ được trả lại cho chủ hàng.

2. Loại bỏ virus và nhân giống

Ghép đỉnh sinh trưởng là kỹ thuật nhân dòng các giống cây có múi đã được loại bỏ bệnh, cùng với khả năng tạo ra những dòng mới sạch Virus và các tác nhân gây bệnh khác. Tất cả cây có múi mới phải được ghép đỉnh sinh trưởng ít nhất một lần trước khi xuất ra khỏi cơ sở Kiểm dịch sau nhập khẩu. Các bước kiểm tra được làm nhiều lần đến khi cho kết quả kiểm tra khẳng định là sạch bệnh. Những gốc ghép được sản xuất từ các tổ chức trên thế giới có chứng nhận đạt tiêu chuẩn thì không cần phải ghép lại ở Việt Nam.

...

...

...

Việc ghép đỉnh sinh trưởng được thực hiện ngay lập tức khi có mắt ghép thích hợp được đưa tới.

Nếu có chồi ghép không thích hợp cho việc ghép ban đầu tại thời điểm nhập khẩu này hoặc mắt ghép được đưa đến trong điều kiện không thích hợp, các mắt ghép được ghép vào thân một cây mẹ và sau đó chọn mắt ghép thích hợp nhất để ghép.

2.2. Xử lý mắt ghép để ghép đỉnh sinh trưởng

Tiệt trùng bề mặt mắt ghép trước khi bắt đầu ghép. Nhúng mắt ghép trong dung dịch Ethanol 70 % trong 2 phút, sau đó nhúng trong dung dịch Chlorin (Clo) 0,2 % hoặc Sodium hypochrorite trong 10 phút. Bảo quản mắt ghép ở nhiệt độ 26 ^oC trong cát ẩm đã tiệt trùng với chu kỳ chiếu sáng 16 giờ đến khi đem ra sử dụng.

2.3. Sản xuất gốc ghép để ghép đỉnh sinh trưởng

Sử dụng chanh ba lá, chanh sần và Citrus grandis (Chỉ dùng cho các giống bưởi Pomelo) làm gốc ghép.

Lấy hạt từ quả tươi sau đó rửa sạch thịt quả. Tách bỏ lớp vỏ ngoài của hạt và bảo quản trong giấy lọc ẩm đến khi đem ra sử dụng. Khử trùng bề mặt hạt trong dung dịch Chlorin 0,5 % hoặc Sodium hypochrorite trong 10 phút. Sau đó rửa kỹ trong nước đã tiệt trùng tối thiểu 3 lần. Đưa hạt vô trùng vào trong môi trường Agar sạch để trong buồng cấy, sau đó đưa vào tủ ấm ở 26 ^oC trong bóng tối.

Nếu hạt không dùng ngay sau khi đã tách khỏi quả, ta phơi trên giá đỡ. Hạt được Tiệt trùng bề mặt và được bảo quản bằng cách nhúng trong dung dịch Chlorin 1 % hoặc Sodium hypochrorite. Sau đó tiến hành làm như đối với hạt tươi.

Hạt sẽ mọc sau 4 - 5 ngày, chanh sần đâm chồi nhanh hơn chanh ba lá. Chuẩn bị những ống tuýp để trồng cây giữ trong môi trường đồng nhất có chứa môi trường hỗn hợp Murshige và Skoog + Đường + agar, tiệt trùng ở 121^oC trong 15 phút. Đặt hạt nảy mầm lên bề mặt agar trong các ống tuýp nuôi cấy khi chồi bắt đầu mọc.

...

...

...

2.4. Ghép đỉnh sinh trưởng

Ngâm dụng cụ trong cồn 70 % khoảng 1 giờ trước khi dùng. Chuẩn bị các mẩu dao cạo và tra vào cán. Nhúng dao cắt vào chất tẩy và sau đó làm sạch bằng cồn và hơ khô giữa mỗi lần cắt. Không làm cháy lưỡi dao sau khi nhúng cồn. Thay đổi lưỡi dao khi chúng bị cùn.

Tiệt trùng bề mặt cành ghép trực tiếp khi đang ở trên cây bằng dung dịch Chlorin 0,5 % hoặc Sodium hypochrorite trong 5-10 phút, tuỳ thuộc vào điều kiện của cành ghép. Nếu chúng đã được tiệt trùng và trồng trong cát, chúng có thể được sử dụng ngay. Nếu chúng bị nhiễm bẩn thì đặt chúng trên vải màn và xử lý trong dung dịch Chlorin 0,01 % hoặc Sodium hypochrorite trong 1 phút sau đó rửa cẩn thận 3 lần trong nước lọc.

Cắt tỉa lá mầm và chồi bên, mở vết ghép hình chữ T và tiến hành ghép.

Loại bỏ hết lá ở cành ghép để lộ mô phân sinh. Sử dụng một lưỡi dao cho một mô phân sinh. Đặt mô phân sinh lên vết ghép và đóng nắp vết ghép lại. Đặt cây con trong giấy lọc và trồng trong ống tuýp có hỗn hợp môi trường Murshige và Skoog + Đường + sắt hoà tan + Vitamin trắng. Xử lý môi trường ở nhiệt độ 121^oC trong 10 phút.

Giữ cây con ở nhiệt độ 28 ^oC với chu kỳ chiếu sáng là 16 giờ. Chăm sóc cây tối thiểu 4 - 6 tuần hoặc có thể dài hơn. Cây con có thể cần được cắt tỉa mầm ở giai đoạn sinh trưởng trong ống tuýp và có thể chuyển vào môi trường mới.

2.5. Chuyển cây con đã được ghép đỉnh sinh trưởng ra khỏi ống tuýp

Sau 4 - 6 tuần, khi mắt ghép đã mọc chồi được 1 cm cùng với 2 lá, đưa cây con ra khỏi ống tuýp; tỉa rễ chồi và trồng cây trong chậu có chứa hỗn hợp chất độn. Giữ cây trong điều kiện ánh sáng yếu trong tuần đầu tiên. Duy trì ẩm độ cao trong vài ngày đầu bằng cách dùng tấm nhựa che phủ cây con. Khi cây cứng cáp ta loại bỏ dần tấm nhựa che phủ. Có thể sử dụng các biện pháp tương tự như trên nếu thấy mắt ghép còn xanh nhưng chưa phát triển. Hàng ngày tưới 2g/l Ca(NO­3)₂.

Kiểm tra các dòng ghép để khẳng định đã loại bỏ hết các bệnh.

...

...

...

3.6. Môi trường nuôi cấy

Môi trường

Các hợp chất

Hàm lượng

Murashige & Skoog

Rắn

Lỏng

...

...

...

1,90 g/l

1,90 g/l

NH₄NO₃

1,65 g/l

1,65 g/l

CaCl₂.2H₂O

440 mg/l

...

...

...

MgSO₄.7H₂O

370 mg/l

370 mg/l

KH₂PO₄

170 mg/l

170 mg/l

...

...

...

16,9 mg/l

16,9 mg/l

ZnSO₄.7H₂O

8,6 mg/l

8,6 mg/l

H₃BO₃

6,2 mg/l

...

...

...

Kl

0,82 mg/l

0,82 mg/l

Na₂MoO₄.2H₂O

0,25 mg/l

0,25 mg/l

...

...

...

0,025 mg/l

0,025 mg/l

CoCl₂.6H₂O

0,025 mg/l

0,025 mg/l

Vitamin trắng

Myo-I-Inositol

-

...

...

...

Nicotinic

-

27,8 mg/l

Pyridoxine

-

100,0 mg/l

...

...

...

-

1,0 mg/l

Sucrose

30 g/l

1,00,2 mg/l

Agar

10 g/l

...

...

...

1.   Pháp lệnh Bảo vệ và Kiểm dịch thực vật số 11/2001/L/CTN do Chủ tịch nước công bố ngày 8/8/2001.

2.   Nghị định 127/2007/NĐ-CP ngày 01/8/2007 của Chính phủ Quy định chi tiết thi hành một số điều của Luật Tiêu chuẩn và Quy chuẩn kỹ thuật.

3.   Thông tư 23/2007/TT-BKHCN ngày 28/9/2007 của Bộ Khoa học và Công nghệ Hướng dẫn xây dựng, thẩm định và ban hành quy chuẩn kỹ thuật.

4.   Cục Bảo vệ thực vật (1996), Lý luận và thực tiễn Kiểm dịch thực vật, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội.

5.    Trung tâm kiêm dịch thực vật Sau nhập khẩu I (2004); Sử dụng chất nền trong nhà trồng cây kiểm dịch thực vật và một số biện pháp xử lý khử trùng, Hà Nội.

6.   L. Smee and P.J. Setchell - Post - entry Quarantine for Imported Plants - Australian Government Publishing Service.

7.    Paul R. Miller - Plant pothologist; Hazel L. Pollard - Technical Information Specialist. Multilingual Compendium of Plant Disease Viruses and Nematodes - Production and Distribution by American Phytopathological Society for The Unites Agency for International Development Incooperation with The Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture.