6.1.2.3 Mẫu kiểm soát độ thu hồi: mẫu trắng bổ sung các chất dẫn xuất nitrophenyl của AOZ, AMOZ, AHD và SEM chuẩn.

Cân chính xác 2 phần có khối lượng 1,0 ± 0,05 g mẫu trắng (đã được chứng nhận), bỏ vào 2 ống ly tâm 14ml (5.1.12). Bổ sung 40ml dung dịch chuẩn nội IS2 (5.5.3.2) rồi để yên trong 15 phút. Sau đó, tiếp tục thuỷ phân và dẫn xuất hoá theo qui định tại Điều 6.2.1.

Sau khi làm bay hơi etyl axetat (6.2.3), thêm vào một mẫu 20ml hỗn hợp chuẩn NP2 (5.5.3.3) và 480ml dung môi hoà tan mẫu (5.4.5). Thêm vào một mẫu khác 50ml hỗn hợp chuẩn NP2 (5.5.3.3) và 450ml dung môi hoà tan mẫu (5.4.5). Sau đó, tiến hành chuẩn bị mẫu phân tích (6.2.4) với công đoạn lọc.

6.2 Xử lý mẫu

Chú thích: Vì các chất dẫn xuất nitrophenyl rất nhậy với ánh sáng nên toàn bộ qui trình xử lý mẫu phải được tiến hành dưới ánh sáng yếu (ánh sáng vàng).

6.2.1 Thuỷ phân và dẫn xuất hoá

Thêm 5 ml axit clohyđric 0,2M (5.4.1) và 50ml dung dịch 2-NBA trong metanol (5.4.3)vào các ống nghiệm chứa mẫu (6.1.1; 6.1.2.1; 6.1.2.2; 6.1.2.3). Đậy nắp ống và lắc bằng tay để phân tán mẫu. Đặt lên máy lắc ống nghiệm (5.1.13) rồi đặt cả hệ thống vào trong tủ ấm. Ủ mẫu qua đêm ở nhiệt độ 37 ± 2^oC.

6.2.2 Trung hoà

Sau khi làm nguội, thêm 500 ml dung dịch Na₃PO₄ 0,3M (5.4.4) vào mẫu. Lắc mẫu bằng tay. Điều chỉnh pH về 7±0,5 bằng dung dịch NaOH 2M (5.4.2), kiểm tra pH bằng giấy thử pH (5.1.9). Lắc bằng tay và để yên trong 5 phút. Kiểm tra lại pH và điều chỉnh thêm nếu cần thiết.

...

...

...

Thêm 4ml etyl axetat (5.2.6) vào mẫu đã điều chỉnh pH. Chiết mẫu bằng cách đặt trên máy lắc đảo đầu (5.1.17) trong 20 phút. Ly tâm mẫu trong 10 phút ở tốc độ 2000 vòng/phút. Chuyển lớp hữu cơ ở phía trên sang một ống ly tâm 14ml (5.1.12) sạch. Lặp lại bước chiết bằng cách thêm 4ml etyl axetat (5.2.6) vào phần mẫu còn lại, đóng nắp ống ly tâm rồi đặt trên máy lắc đảo đầu (5.1.17) trong 20 phút. Ly tâm mẫu trong 10 phút ở tốc độ 3500 vòng/phút. Lấy lớp hữu cơ và kết hợp với phần hữu cơ đã lấy ở lần đầu rồi làm bay hơi cho đến khô ở nhiệt độ 45^oC với hệ thống cô bằng khí nitơ (5.1.6) với tốc độ dòng khí chậm.

Chú thích: tổng thể tích phần hữu cơ phải lớn hơn 6 ml, nếu không phải chiết thêm một lần nữa.

6.2.4 Chuẩn bị mẫu phân tích

Hoà tan cặn khô bằng 500ml dung môi hoà tan mẫu (5.4.5), lắc trên máy lắc Vortex (5.1.7) trong 20 giây. Lọc dịch đục qua màng lọc 13mm, 0,45mm (5.1.8) và thu dịch lọc vào lọ vial cho HPLC (5.1.14).

6.2.5 Phân tích trên LC/MS/MS

6.2.5.1 Điều kiện máy LC

a. Tốc độ: 0,4 ml/phút;

b. Thể tích mẫu tiêm: 50 ml;

c. Nhiệt độ cột: 40^oC;

...

...

...

đ. Pha động: chế độ gradien theo Bảng 2

Bảng 2 - Điều kiện gradien dung môi của máy LC

Thời gian (phút)

Pha động A (5.4.6) (%)

Pha động B (5.4.7) (%)

0

90

10

1

...

...

...

10

14

55

45

16

10

90

18

10

...

...

...

19

90

10

6.2.5.2 Điều kiện của đầu dò MS

a. Tỉ số chia: xấp xỉ 1 : 2

b. Kiểu ion hoá:  ESI, dương

c. Điện thế mao quản: 2,7 kv

d. Điện thế khối nón: 30 v

đ. Nhiệt độ nguồn: 120^oC

...

...

...

g. Tốc độ dòng khí khử dung môi: 500 l/h

h. Tốc độ khí qua khối nón: 200 l/h

i. Khí gây phân ly bằng va chạm: Argon, p = 3,2.10^-3 bar.

6.2.5.3 Điều kiện phân ly MS/MS

NPAOZ, NPAMOZ, NPAHD và NPSEM bị phân ly thành các ion thứ cấp liên quan đến cấu trúc. Các chất đồng vị đánh dấu được sử dụng làm chất chuẩn nội cũng có cách phân ly tương tự (Bảng 3).

Bảng 3 - Các điều kiện phân ly MS/MS

Thành phần

Ion sơ cấp (m/z)

Ion thứ cấp (m/z)

...

...

...

Năng lượng va chạm (eV)

Cửa sổ (phút)

NPAMOZ

335 ± 0,5

262 ± 0,5

291 ± 0,5

0,3

0,3

15

...

...

...

0,0 - 8,5

0,0 - 8,5

NPAMOZ-d₅

340 ± 0,5

296 ± 0,5

0,3

15

0,0 - 8,5

NPAHD

...

...

...

134 ± 0,5

178 ± 0,5

0,2

0,2

15

15

8,5 - 13,0

8,5 - 13,0

NPAHD-d₂

...

...

...

134 ± 0,5

0,2

15

8,5 - 13,0

NPSEM

209 ± 0,5

166 ± 0,5

192 ± 0,5

0,2

...

...

...

10

10

8,5 - 13,0

8,5 - 13,0

NPAOZ

236 ± 0,5

104 ± 0,5

134 ± 0,5

0,3

...

...

...

17

17

13,0 -18,0

13,0 -18,0

NPAOZ-d₄

240 ± 0,5

134 ± 0,5

0,3

17

...

...

...

Chú thích: các ion thứ cấp có cường độ cao nhất được gạch chân.

6.2.6 Kiểm tra hiệu năng của hệ thống LC/MS/MS

Tiêm dung dịch chuẩn làm việc 1mg/l (5.5.4). Xác định tỷ lệ tín hiệu/nhiễu (S/N) đối với bước chuyển có cường độ thấp nhất. Tỷ lệ S/N phải lớn hơn 6. Lặp lại bước tiêm để kiểm tra sự lặp lại của thời gian lưu, diện tích pic và tỉ lệ các ion.

6.2.7 Trình tự tiêm mẫu

Các mẫu sẽ được phân tích theo trình tự sau:

a. Dung môi trắng;

b. Mẫu kiểm soát âm tính (6.1.2.1);

c. Mẫu kiểm soát dương tính (6.1.2.2);

d. Mẫu kiểm soát độ thu hồi (6.1.2.3);

...

...

...

e. Mẫu cần kiểm nghiệm (6.2.4);

g. Dung môi trắng;

h. Mẫu kiểm soát âm tính (6.1.2.1);

i. Mẫu kiểm soát dương tính (6.1.2.2).

7 Tính kết quả

7.1 Tính tỉ số ion theo công thức sau:

R (%) =

100 x A₁

(1)

...

...

...

Trong đó:

- R là tỉ số ion (%).

- A₁ là diện tích của pic ion thứ cấp có cường độ thấp nhất.

- A₂ là diện tích của pic ion thứ cấp có cường độ cao nhất.

7.2 Tính độ lệch tương đối của tỉ số ion theo công thức sau:

∆R (%) =

R_s - R_m

x 100    (2)

R_m

...

...

...

- ∆R là độ lệch tương đối giữa tỉ số ion của chất cần phân tích trong mẫu kiểm với tỉ số ion trung bình của chất đó trong mẫu kiểm soát dương tính có nồng độ 1 mg/kg và cao hơn (%).

- R_s là tỉ số ion của chất cần phân tích trong mẫu kiểm (1).

- R_m là tỉ số ion trung bình của chất cần phân tích trong mẫu kiểm soát dương tính có nồng độ 1 mg/kg và cao hơn (%) (1).

7.3 Tính thời gian lưu tương đối theo theo công thức sau:

Rrt

Rt

(3)

Rt_IS

Trong đó:

...

...

...

- Rt là thời gian lưu của chất cần phân tích.

- Rt_IS là thời gian lưu của chất chuẩn nội (đối với NPSEM thì NPAHD-d₂ là chất chuẩn nội).

7.4 Tính độ lệch chuẩn của thời gian lưu tương đối theo công thức sau:

∆Rrt (%)

Rrt_s - Rrt_m

x 100    (4)

Rrt_m

Trong đó:

- ∆Rrt là độ lệch tương đối giữa Rrt của chất cần phân tích trong mẫu kiểm so với Rrt của chất đó trong mẫu kiểm soát dương tính (%).

...

...

...

- Rrt_m là thời gian lưu tương đối trung bình của chất cần phân tích trong mẫu kiểm soát dương tính.

7.5 Chất cần phân tích được khẳng định là có mặt khi các yêu cầu sau được thoả mãn:

a. Tỷ lệ tín hiệu/nhiễu cho mỗi ion phải không nhỏ hơn 3:1.

b. Mức dung sai tối đa cho phép của các cường độ ion tương đối, sử dụng nhiều loại kỹ thuật khối phổ theo qui định trong Bảng 4.

Bảng 4 - Mức dung sai tối đa cho phép của các cường độ ion tương đối

Cường độ tương đối

(% của pic cơ sở)

LC-MS, LC-MSn

(tương đối)

...

...

...

± 20 %

Từ lớn hơn 20 đến 50 %

± 25 %

Từ lớn hơn 10 đến 20 %

± 30 %

Không lớn hơn 10 %

± 50 %

7.6 Tính hệ số tín hiệu cho từng chất cần phân tích theo công thức sau:

RF =

...

...

...

(5)

Sp_IS

Trong đó:

- RF là hệ số tín hiệu.

- Sp là tổng diện tích pic của các ion thứ cấp của chất cần phân tích.

- Sp_IS làdiện tích pic của ion thứ cấp của chất chuẩn nội (đối với NPSEM, NPAHD-d₂ được sử dụng làm chất chuẩn nội).

7.7 Tính lượng chất cần phân tích có mặt trong mẫu kiểm theo công thức sau:

X =

RF - b

...

...

...

a

Trong đó:

- X là lượng chất cần phân tích có trong mẫu kiểm (mg/kg). ^(*)

- RF là hệ số tín hiệu (công thức 5).

- b là độ dựng của đường chuẩn tính theo phương pháp hồi qui tuyến tính.

- a là độ dốc của đường chuẩn tính theo phương pháp hồi qui tuyến tính. ^(**)

Chú thích: (*) : tính theo khối lượng chất chuyển hoá chưa bị dẫn xuất hoá.

(**): dựng đồ thị tín hiệu của mẫu kiểm soát dương tính với nồng độ chất chuẩn bổ sung và áp dụng hồi qui tuyến tính.

...

...

...

(tham khảo)

SỰ CHUYỂN HOÁ CỦA CÁC CHẤT THUỘC NHÓM NITROFURAN

Dược chất                                                        Chất chuyển hóa